灵芝提取的小分子化合物提高铂类药物抗癌效果：抑制跨损伤DNA合成
灵芝提取的小分子化合物提高铂类药物抗癌效果：抑制跨损伤DNA合成
顺铂（CDDP）等铂类药物是治疗多种癌症的重要药物，但其耐药性问题限制了其疗效。近期研究发现，从灵芝中提取的小分子化合物Ganoboninketal C（26-3）能够通过抑制跨损伤DNA合成（TLS）通路，显著增强铂类药物的抗癌效果，并降低耐药性。
研究背景
顺铂（CDDP）等相关铂类药物已被广泛用于治疗多种人类癌症。它们通过与DNA产生嘌呤碱基的链内交联如1,2-链内d（GpG）（Pt-GG）和1,2-链内d（ApG）（Pt-AG）加合物，阻断DNA复制并在快速分裂的细胞中引起细胞凋亡，达到肿瘤杀伤效果。然而，铂类药物的获得性或内在耐药性极大限制了其在癌症治疗中的应用。因此，如何提高CDDP的化疗疗效，并制定新的治疗策略来克服CDDP耐药性成为当务之急。
研究表明，跨损伤DNA合成（TLS）通路与CDDP耐药性产生密切相关，抑制该通路，如靶向TLS聚合酶REV1的小分子化合物JH-RE-06，能显著促进肿瘤对放化疗的应答。然而目前已发现的TLS抑制剂非常有限，开发更多的TLS通路抑制剂，有助于改善肿瘤化疗疗效。以往研究显示TLS聚合酶Polη不仅可以正确复制紫外线（UV）诱导的环丁烷-嘧啶二聚体（CPD），还可以复制CDDP诱导的Pt-GG加合物，Polη的表达上调有助于卵巢癌干细胞产生CDDP耐药。因此，抑制Polη的TLS功能有望降低铂类药物的耐药性。灵芝是亚洲著名的传统草药，据报道它可产生多种生物活性化合物，包括三萜类、美罗替萜类、生物碱和酚类。由于其重要的药理活性，近年来对灵芝抗肿瘤作用的研究越来越多，例如，一些三萜类化合物已被证明具有多种抗癌活性。然而关于灵芝详细的抗癌机理还不完全清楚。其是否能通过抑制TLS通路发挥作用，如果是，具体是通过什么组分发挥作用的，这些问题都值得深入探讨。
太原理工大学马晓璐讲师、中国科学院微生物研究所刘宏伟研究员、中国科学院北京基因组研究所郭彩霞研究员等在本研究中报道了一种从灵芝分离出的天然TLS通路抑制剂Ganoboninketal C（灵芝提取组分编号为26-3）。26-3不仅增强了顺铂和吉非替尼的肿瘤杀伤效果，而且还抑制了顺铂诱发的突变。此外，转录组测序分析表明，联用26-3可以下调顺铂诱发的Polη和PIDD（已知的TLS通路促进分子）的表达上调，揭示了26-3抑制TLS的作用机制。此外，对经顺铂处理后表达上调，而联用26-3表达得到逆转的差异表达基因进行初步分析，还发现了一些潜在的TLS通路调控因子，有待未来继续探讨。
研究结果
26-3是一种天然TLS抑制剂
为了筛选TLS通路抑制剂，作者首先建立了一个包含100多种灵芝提取物的小分子化合物库，鉴于顺铂处理细胞能诱发Polη形成显微镜下可见的foci，作者比较了小分子与顺铂联用后对Polη foci形成的影响。结果发现联用灵芝提取物Ganoboninketals A（编号为26-1）和C（编号为26-3）显著降低了CDDP处理后Polη foci的形成。进一步分析发现26-3单独使用并不改变PCNA单泛素化修饰（PCNA-mUb）水平，不能激活TLS通路，但其与CDDP联用能显著削弱PCNA单泛素化、抑制RAD18与染色质的结合、以及干扰RPA32的 foci形成。更进一步，作者还发现，26-3与CDDP联用能显著降低顺铂处理后细胞的突变频率。这些结果表明26-3是一个天然的TLS通路抑制剂。
图1 Ganoboninketal C（26-3）是一种新型的天然TLS抑制剂
26-3促进顺铂和吉非替尼的肿瘤杀伤效果
虽然26-3单独用药对多种肿瘤细胞系的存活有部分抑制，但26-3与CDDP联合用药显著提高了细胞对CDDP杀伤的敏感性。利用膜联蛋白V/PI分析发现，26-3与CDDP联合用药导致膜联蛋白V阳性细胞比例与CDDP单独用药相比明显增加、以及肿瘤干细胞CSCs富集显著降低，表明26-3可以阻止铂类化疗期间CSC的富集。
图2 26-3使肿瘤细胞对CDDP杀伤敏感
研究报道，持留性癌细胞（persistent cells）可以通过上调TLS聚合酶进而激活应激诱导的诱变机制，促进EGFR抑制剂（吉非替尼）处理后的细胞存活。作者发现26-3单独用药对细胞几乎没有毒性作用。26-3与吉非替尼联合用药时，其杀伤效果明显高于或者接近高剂量吉非替尼单独用药治疗的抗肿瘤效果，表明26-3具有提高EGFR靶向治疗临床疗效的巨大潜力。
图3 26-3增强A549和H1299细胞对吉非替尼的杀伤能力
26-3抑制CDDP诱导TLS活性的潜在机制
利用RNA-seq分析，作者发现CDDP与26-3联合用药可以在很大程度上逆转CDDP单独用药对基因表达的影响。值得注意的是，PIDD和POLH，两个已被报道促进PCNA-mUb的基因，它们均在CDDP单独用药后上调但被26-3联用CDDP所逆转。此外，作者还发现ATF3、GREB1和FHL2是新的潜在TLS调节因子，其表达被CDDP上调，但被CDDP联用26-3逆转。ATF3，GREB1和FHL2的敲低降低了CDDP诱导的PCNA-mUb，其中ATF3敲低具有最显著的抑制作用。在ATF3敲低的细胞中回补ATF3能够显著提高UV和CDDP处理后的PCNA-mUb。因此，联用26-3抑制TLS的作用可能至少部分是通过降低一些能促进PCNA-mUb的因子表达实现的。
图4 26-3下调多个TLS相关因子抑制TLS激活
结论
灵芝提取物Ganoboninketals C（26-3）可以显著降低顺铂诱导的TLS聚合酶η（Polη）foci形成、PCNA单泛素化以及突变频率。26-3可显著提高顺铂杀伤多种肿瘤细胞的效果，促进肿瘤细胞凋亡、抑制化疗处理后肿瘤干细胞的富集。此外，26-3联用EGFR抑制剂吉非替尼也显著提高靶向治疗的敏感性。RNA-seq分析显示，26-3可以逆转CDDP诱导的Polη、PIDD和ATF3的表达上调。因此，天然TLS抑制剂26-3可以作为潜在的提高化疗疗效的佐剂，用于敏化铂类药物或某些靶向治疗的肿瘤杀伤作用。
参考文献
MA X L, YANG F, MA K, et al. Ganoboninketal C fromGanoderma boninenseimproves the efficacy of CDDP-based chemotherapy through inhibiting translesion DNA synthesis[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2982-2992. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250241.
本文原文来自科学网，作者为马晓璐、刘宏伟、郭彩霞等研究人员。