文献解析|人多能干细胞衍生下胚层对上胚层发育的调节机制

文献解析|人多能干细胞衍生下胚层对上胚层发育的调节机制

背景介绍

早期胚胎发育是生物体形成的关键阶段，然而，由于人类早期胚胎获取的难度以及伦理限制，对这一过程的研究面临诸多挑战。类胚体形成作为一种研究模型，通过诱导胚胎干细胞聚合来模拟早期胚胎发育过程，但并不会真正形成个体，目前已成为研究人类早期胚胎发育的主要方法。

最新研究进展

2023年12月5日，日本京都大学Yasuhiro Takashima和Takuya Yamamoto研究团队在《Nature》发表题为“Hypoblast from human pluripotent stem cells regulates epiblast development”的文章，深入探讨了体外类胚体组装过程中下胚层对上胚层发育的调节机制。

作者团队采用过表达和化学诱导两种方法，将幼稚态人多能干细胞（naïve hPSC）转化为真下胚层（nHyC）。nHyc与naïve hPSC共组装可形成具有羊膜腔的双层结构（bilaminoid）。在额外添加由naïve hPSC转化而来的滋养外胚层后，bilaminoid的组装效率从20%提升至40%，其中的上胚层在滋养外胚层分泌的IL6作用下能够继续发育。Bilaminoid的发育过程重现了前后轴的差异化发育以及原肠运动前的细胞形成过程，并揭示了DKK1/OTX2对这一过程的调控作用。由此，研究人员成功模拟并阐明了胚外组织在上胚层发育过程中的重要引导作用。

为实现naïve hPSC向nHyC的转化，作者采用了过表达关键转录因子及外源添加细胞因子的双重策略。通过过表达内层特异性转录因子，可诱导hPSC表达一系列下胚层相关基因，进而促使细胞发生从hPSC向nHyC的转变，表现为PDGFRA标志物的阳性表达，其中GATA6的过表达效果最为显著。经此方法处理后的naïve hPSC可稳定表达下胚层特异性标志物，而prime hPSC则主要表达中胚层标志物。研究者进一步利用RNA-seq技术对naïve和prime hPSC在转化过程中的基因表达谱进行了全面分析。

在植入过程中，naïve EPI细胞逐步建立极性并逐渐分化为植入后EPI细胞和羊膜细胞，下胚层则分化为内脏内胚层和胚外卵黄囊。将naïve hPSC与nHyC细胞混合，可促进类胚体的组装。为区分两种细胞，nHyC中插入了GFP荧光蛋白。在N2B27培养基（含10 μM Y27632）中，转化过程持续4天，至第2天时，nHyC逐渐转移至胚体外侧，形成双层结构。在转化过程中，PAR6逐渐变为中央表达，而PODXL和aPKC则逐渐变为周围表达，显示出胚轴极性的建立。

在植入过程中，naïve hPSC通过抑制FGF和TGF-β信号通路可分化为滋养细胞（TE），在培养液中添加PD03和A83可促进其向滋养外胚层的分化。为探究滋养外胚层对胚盘结构形成的影响，作者首先通过流式检测Bilaminoid中TE样细胞的存在情况，结果显示仅有极少量细胞为HAVCR1+/ENPEP+的nTE，表明在组装过程中大部分细胞未分化为nTE，从而排除了Bilaminoid中TE的影响。随后，在transwell小室中添加nTE后，发现胚盘中所有细胞的增殖能力均有所提高，羊膜腔的形成效率也显著提升。通过逐个补充TE产生的细胞因子，发现第4天添加IL6和PDGFA可有效提高羊膜腔的形成效率。敲除nTE中的IL6使其丧失了原本的增强功能。通过分别在Epi和HyC细胞中补充Y118F以增强IL6下游JAK/STAT3通路的激活，发现Epi是IL6的主要作用对象。培养至第6天时，在上胚层与下胚层交界处出现了T阳性的细胞，而在未加入nHyC的对照中则未观察到T阳性的细胞，提示下胚层参与了中胚层的形成。

为探究 Bilaminoid 与自然发育胚胎的差异，作者对培养至第 6 天的 Bilaminoid 进行了单细胞测序。与正常发育的胚胎相比，Bilaminoid 中未出现滋养层细胞（TE），其他细胞均呈现正常分化，且在第 6 天时，Bilaminoid 已经出现了部分具有前内脏内胚层特征的细胞，这表明 Bilaminoid 已经开始了前后轴的分化。

为了进一步研究 Bilaminoid 中的前后轴形成过程，作者通过在 CER1（前轴标记物）基因上插入 GFP。在第 6 天时，CER1 阳性的细胞位于 T 阳性细胞的远端，OTX2（前轴标记物）阳性的细胞同样位于 T 阳性细胞的远端。当在下胚层细胞中过表达 OTX2 或 DKK1 时，T 的表达会受到影响，这表明下胚层对前后轴的形成具有重要作用。此外，Bilaminoid 中的下胚层会形成类似基底膜的结构，并通过整合素 α6β1 影响上胚层的分化。研究还发现，敲除下胚层中的 LAMB1（基底膜结构蛋白之一）会导致基底膜无法形成，进而影响前羊膜腔的形成及上胚层的分化。

为了深入探究 Bilaminoid 中上胚层的分化过程，作者将 Bilaminoid 培养至第 9 天。此时，Bilaminoid 中已经出现了多种具有特定标志物的细胞类型：表达 ISL1 和 GATA3 的羊膜上皮细胞、表达 BLIMP1 和 TFAP2C 的原始生殖细胞，以及 CD34+/ERG+ 的造血祖细胞。

该研究通过多种体外诱导方法，将naïve hPSC分化为下胚层细胞，并以体外自组装方式构建了源于naïve hPSC的类胚体，成功培养至第9天。研究揭示了FGF、BMP和Activin-A通过差异性激活与抑制机制调控naïve hPSC分化；阐明了滋养外胚层借助IL6促进上胚层分化的作用；证实了下胚层参与前后轴形成，并通过基底膜影响上胚层分化。