CCK-8实验详细操作流程

CCK-8实验详细操作流程

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CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验是一种常用的细胞增殖和毒性检测方法，广泛应用于药物筛选、细胞生物学研究等领域。该方法通过检测细胞内脱氢酶的活性来反映细胞的增殖情况，具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点。本文将详细介绍CCK-8实验的具体操作流程和关键注意事项。

实验步骤

1. 实验准备：准备完全培养基（完培）、PBS、CCK-8试剂盒、96孔板和细胞计数板。确保所有仪器设备，包括培养箱、显微镜、超净工作台和酶标仪，均已正确调试并处于待用状态。

2. 实验操作：在96孔板的每个孔中加入100μL的细胞悬液。根据以往经验，100μL的体积通常含有1000-3000个细胞。然而，具体的细胞数量会因为细胞大小和增殖速度的不同而有所变化，因此建议进行预实验以确定最佳条件。

• 注意：在每个实验组中设置3-5个重复孔；此外，在外围环绕一圈PBS，以减少培养基蒸发对实验结果的影响。
• 初步孵育：将细胞板置于37°C、5% CO₂的培养箱内预培养24小时，以确保细胞充分贴壁。
• 药物处理：贴壁后，从孔中吸出原有培养基。在实验组中加入含药物的培养基，而在对照组中加入不含药物的培养基。
• 进一步孵育：将细胞板重新置于37°C、5% CO₂培养箱进行孵育以达到指定培养时间。
• CCK-8处理：在每个孔中加入10μL的CCK-8试剂（或按CCK-8与培养基=1:10的比例），确保无气泡形成，以免影响后续的吸光度（OD值）读数。
• 后续孵育：将处理后的板子在培养箱中继续孵育1至4小时。注意保持各实验组的孵育时间一致，以确保细胞活力比较的准确性。
• 吸光度测量：使用酶标仪在450 nm处测量吸光度，该读数自带间接反映出活细胞数量。
• 终止反应注意事项：如果暂时不进行即刻测量，可将板子置于4°C冰箱中保存，建议在24小时内完成测量。如果需要进行细胞数量的精确测量，可以通过绘制标准曲线来确保OD值在1-2之间，以便于进行准确分析。

注意事项

1. 如果细胞培养的起始体积为200μL，则需要加入20μL的CCK-8溶液进行处理，遵守比例以确保反应条件一致。如体积不同，以此类推进行调整。
2. 每个药物浓度建议设置3个重复孔，最后取其均值用于生成剂量反应曲线，以提高结果的可靠性和统计学意义。
3. 为了尽量排除实验中其他因素的干扰，须精心设计对照组：

• 空白对照：包括等量的细胞培养液、CCK-8溶液和药物，但不包含细胞的孔位。
• 阴性对照：包含药物溶剂但不含药物的细胞孔位。

4. 由于本试剂盒依赖于脱氢酶催化反应，当待测物质具有氧化性或还原性时，可能干扰检测。为此，可在加入CCK-8溶液前更换新鲜的培养基以消除药物影响；如药物影响较小，也可通过扣除培养基中加药物的空白吸收值进行校正。
5. 加入CCK-8溶液后，需要注意孵育时间的长短，其决定因素包括细胞类型和密度等实验条件。初次实验时，可分别在0.5、1、2和4小时进行酶标仪检测，选取吸光度范围适宜的一个时间点用于后续实验的标准化操作。
6. 在培养过程中，培养板外圈孔位的液体容易挥发干燥，从而导致体积不准确增大误差。为了确保数据的准确性，建议最外圈的孔只添加培养基，而不参与正式检测。
7. 如果暂时无法立即测定OD值，可以通过每孔中加入10μL 10% SDS溶液“来终止反应，并将板子遮光保存在室温下。24小时内进行测量，其吸光度变化不大，但最佳实践仍然建议尽快检测。
8. 在酶标仪检测前，确保每个孔内没有气泡，因为气泡会干扰其光路，影响吸光度测量的准确性。