资讯

历史

科技

环境与自然

成长

游戏

财经

文学与艺术

美食

健康

家居

文化

情感

汽车

三农

军事

旅行

运动

教育

生活

星座命理

从造血干细胞和祖细胞中生成CAR-NKT细胞的新方法

创作时间:

作者:

@小白创作中心

从造血干细胞和祖细胞中生成CAR-NKT细胞的新方法

引用

来源

https://bydrug.pharmcube.com/news/detail/288049e08b6760d386a765d438d0bd51

2024年5月14日，《Nature Biotechnology》期刊发表了一篇重要研究论文，介绍了一种从造血干细胞和祖细胞中生成CAR-NKT细胞的新方法。这项研究采用了一种极具临床应用和指导意义的方法分化和扩增IL-15表达增强型的AlloCAR-NKT细胞，可靶向7种癌症细胞，并在多发性骨髓瘤动物体内模型中证明了它们的抗肿瘤功效、扩张性和持久性。

研究背景

CAR-T细胞疗法已获得美国食品药品监督管理局批准用于治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤（MM），但自体CAR-T细胞产品存在成本高、制造时间长和患者可及性有限的问题。目前正在探索的方法有两种：一种是使用传统的αβ T细胞，消除内源性T细胞受体（TCR）的表达，以最大限度地降低移植物抗宿主病（GvHD）的风险。另一种是使用具有低GvHD风险的细胞类型，如巨噬细胞、NK细胞和不变自然杀伤T细胞（iNKT或NKT）。

NKT细胞具有不变的TCRα链（人：TRAV10-TRAJ18，小鼠：TRAV11-TRAJ18）和NK细胞双重标志，是一种独特的T细胞，在人类血液中相对罕见，仅占循环T细胞的0.001-1%。NKT细胞的TCR识别非多态性主要组织相容性复合物类分子CD1d，所以不会诱导GvHD。

在临床研究中，自体CAR-NKT细胞已显示出治疗复发或耐药神经母细胞瘤的功效，而不会引起明显的毒性或细胞因子释放综合征（CRS）。但目前NKT细胞疗法的发展受到以下因素的限制：人类血液中NKT细胞的稀缺性以及难以从PBMC中大量扩增NKT细胞。因此，确定临床上适用于非PBMC来源的同种异体NKT细胞的方法是十分重要的。

造血干细胞和祖细胞（HSPC）可通过基因工程改造并分化为各种类型的免疫细胞，包括NKT细胞。在之前的研究中使用人工胸腺类器官培养方法将工程化的脐带血HSPC分化为NKT细胞，但三维（3D）培养和异种饲养细胞的使用阻碍了规模化和临床生产。

综上所述，本文描述了一种不含3D培养物和饲养层细胞的方法，将基因改造后的造血干/祖细胞分化为携带CAR的同种异体自然杀伤T细胞（AlloCAR-NKT细胞），并在多发性骨髓瘤模型中证明了它的抗肿瘤功效、扩增能力和持久性。

研究设计

这项研究通过不含3D培养物和异种饲养细胞的方法，产生了靶向两种血液癌标志物（BCMA和CD19）和三种实体瘤标志物（GD2、GPC3和EGFRvIII）的AlloCAR-NKT细胞以及人IL-15工程化的Allo/15 CAR-NKT细胞。研究者们在多发性骨髓瘤模型中对AlloCAR-NKT细胞进行了全面的临床前研究，以评估其生产、药理学、疗效、作用机制、药代动力学和/或药效学（PK-PD）、安全性和免疫原性。

研究结果

AlloCAR-NKT细胞的体外生成及其表型和功能

图1.AlloNKT和AlloCAR-NKT细胞的产量高、纯度高、稳定性好。

将CD34+ HSPC用慢病毒载体转导人iNKT的TCR、CAR和其他基因（图1a b）。CAR可靶向多种肿瘤抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、CD19、GD2、GPC3和表皮生长因子受体变体III (EGFRvIII)，并含有不同的共刺激结构域，包括CD28和4-1BB（图1d）。

将基因工程改造的HSPC培养6周并经过四个阶段：第1阶段HSPC扩增（2周）、第2阶段NKT分化（1周）、第3阶段NKT深度分化（1周）和第4阶段NKT扩增（2周），得到的成熟AlloCAR-NKT细胞实现了超过106倍的扩增（图1b c）。CAR基因或CAR和IL-15基因的导入不干扰同种异体NKT细胞的分化，并产生了与iNKT TCR共表达CAR（和IL-15）的同种异体NKT细胞（图1f）。

流式细胞术和单细胞TCR测序分析显示，转导的iNKT TCR在AlloCAR-NKT细胞中均匀表达，且未检测到随机重组的内源性αβ TCR（图1e h）。Allo/15BCAR-NKT细胞可表达高水平的NK受体（NKRs）和中央记忆标记物，并产生极高水平的效应细胞因子和细胞毒性分子（图1j）。

AlloCAR-NKT细胞的体外抗肿瘤功效和作用机制

图2.AlloCAR-NKT细胞直接杀死肿瘤细胞，并使用多种靶向机制。

AlloCAR-NKT细胞通过多种表面受体靶向肿瘤细胞，包括CAR的识别、CD1d的TCR识别和大多数肿瘤细胞上表达的NK配体的NKR识别（图2a）。收集MM患者的原代骨髓（BM）样品，用于检测Allo/15BCAR-NKT细胞的肿瘤细胞的体外杀伤功效（图2b）。结果表明，Allo/15BCAR-NKT细胞在消灭MM细胞方面表现出更强的杀伤活性，且具有一定的不依赖CAR的肿瘤杀伤潜力(图2d e)。

研究进一步验证了Allo/15 BCAR-NKT细胞的CAR/TCR/NKR三重靶向机制（图2f-n）。在CD1d/αGC存在下，Allo/15 BCAR-NKT细胞更有效地杀伤肿瘤细胞，表明其具有TCR定向靶向机制(图2i)。Allo/15 BCAR-NKT细胞可以通过NKR（即NKG2D和DNAM-1）识别杀死BCMA−CD1d−肿瘤细胞，证实了NKR介导的靶向机制（图2k l）。

通过扫描电镜（SEM）可视化了Allo/15 BCAR-NKT细胞对MM.1S肿瘤细胞的直接识别和攻击（图2j）。由于其多重靶向机制（图2f-1）和强大的细胞毒功能（图1j），与BCAR-T细胞相比，Allo/15BCAR-NKT细胞显示出更好的肿瘤细胞杀伤效果（图2e i）。

AlloCAR-NKT细胞的体内抗肿瘤功效和PK-PD

图3.AlloCAR-NKT细胞在体内表现出有效的抗肿瘤功效，与有效的肿瘤归巢、扩增和长期持久性相关。

为了研究Allo/15BCAR-NKT细胞的体内抗肿瘤功效，研究者使用人MM异种移植NSG小鼠模型进行了活体成像实验（图3）。在重肿瘤负荷条件下，在大多数实验小鼠中单次施用Allo/15BCAR-NKT细胞实现了肿瘤消除，并且所有实验小鼠都实现了长期（>80天）存活（图3c-e）。

在相同重肿瘤负荷条件下的PK-PD研究中，Allo/15BCAR-NKT/FG细胞扩增超过200倍并持续存在超过80天（图3h i）。这些细胞还表现出强大的肿瘤归巢能力，作用期间可优先归巢至MM肿瘤部位（图3j k），这种归巢能力可能有助于它们的高响应率（图3c-e）。

Allo CAR-NKT细胞的体内基因谱

图4.AlloCAR-NKT细胞显示出与混合T/NK细胞特征相关的体内基因谱，具有强大的效应和/或记忆功能以及衰减的耗竭特性。

使用了人MM异种移植NSG小鼠模型与单细胞RNA测序（scRNA-seq）来分析研究Allo/15BCAR-NKT细胞体内抗肿瘤性能的基因组和分子调控（图4a）。第35天重新刺激的Allo/15BCAR-NKT细胞表现出与第0天相似的肿瘤细胞杀伤能力，且观察到更好的效应细胞和/或记忆细胞群（图4c d）。这些结果表明，同种异体CAR-NKT细胞尽管在体内长期暴露于肿瘤，但仍保留了再激活的巨大潜力。

与BCAR-T细胞相比，Allo/15BCAR-NKT细胞显示增强的效应和记忆能力以及减弱的耗竭基因谱（图4g i）。Allo/15BCAR-NKT细胞增加的NK细胞特征反映在其NKR表达增加和NKR介导的肿瘤细胞杀伤稳健（图2k l）。相反，AlloCAR-NKT细胞中NK特征的体内增强与耗竭迹象无关（图4e g i）。

AlloCAR-NKT细胞拮抗肿瘤免疫逃避、靶向TME和AlloCAR-NKT细胞的安全性

图5.AlloCAR-NKT细胞可以阻断肿瘤抗原逃逸，改变TME并表现出低CRS特征。

对体内收集的MM肿瘤细胞进行scRNA-seq分析（图4a和5a）。用BCAR-T细胞治疗的肿瘤中BCMA抗原表达减少，由于Allo/15BCAR-NKT细胞采用的多种肿瘤靶向机制，所以该细胞处理的肿瘤中并未观察到BCMA抗原损失（图5b c）。

研究人员使用来自MM患者的原代样品（图5d）和体内MM NSG异种移植模型（图5h）来研究Allo/15BCAR-NKT细胞和MM的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）之间的相互作用。在第一项研究中，Allo/15BCAR-NKT细胞有效且选择性地耗尽肿瘤相关巨噬细胞和MDSC，避开了不表达或表达低水平CD1d的其他免疫细胞群，包括粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和HSPC（图5f g）。

在第二项研究中，用Allo/15BCAR-NKT细胞处理有效地耗尽了BM中的CRS相关巨噬细胞群体（图5j k n），并降低了血清中的CRS相关标志物（图5p q）。

AlloCAR-NKT细胞的低免疫原性

图6.AlloCAR-NKT细胞表现出较低的GvHD风险和对同种异体排斥反应的高抗性。

使用体外混合淋巴细胞反应（MLR）测定（图6a）以及体内MM异种移植模型来评估GvHD的风险（图3a）。在体内MM NSG异种移植物模型中，BCAR-T细胞引发严重的GvHD，而Allo/15BCAR-NKT细胞治疗实现了实验动物的无GvHD长期存活（图3e和6c d）。

为了评估Allo/15BCAR-NKT细胞的同种异体排斥，进行了两次体外MLR测定（图6e g）。第一个MLR测定实验中，与BCAR-T细胞相比，Allo/15BCAR-NKT细胞诱导较低的IFN γ产生（图6f）。第二个MLR测定显示，与BCAR-T细胞相比，Allo/15BCAR-NKT细胞显示出极大改善的存活率（图6h）。

在体外细胞培养物和体内抗肿瘤研究中，Allo/15BCAR-NKT细胞的表面HLA-I、HLA-II和NK配体（即ULBP-1）表达水平较低（图6i-k）。对Allo/15BCAR-NKT细胞的全基因组甲基化测序分析显示，许多HLA和NK配体基因的启动子区存在超甲基化（图6n），表明表观遗传调控可能导致Allo/15BCAR-NKT细胞的低免疫原性表型。

HSPC和PBMC衍生的CAR-NKT细胞的比较

图7.AlloCAR-NKT细胞表现出与PBMC衍生的CAR-NKT细胞相似的抗肿瘤能力，但具有增强的NK属性。

对Allo/15BCAR-NKT细胞和PBMC衍生的IL-15增强的BCAR-NKT（PBMC/15CAR-NKT）细胞进行了并行比较（图7a-j）。分析揭示了两种类型的BCAR-NKT细胞之间的实质相似性，包括它们产生高水平效应细胞因子和细胞毒性分子的能力（图7e）。与PBMC/15CAR-NKT细胞相比，Allo/15BCAR-NKT细胞表达更高水平的NKR（例如，DNAM-1、NKp44和NKp30）（图7d）。

使用体外肿瘤细胞杀伤测定以及人MM异种移植物NSG小鼠模型评估两种BCAR-NKT细胞的抗肿瘤功效（图7f h）。两种BCAR-NKT细胞在体外和体内均显示出在杀死BCMA+MM肿瘤细胞方面相似的抗肿瘤功效（图7g-k）。与PBMC/15CAR-NKT细胞相比，Allo/15BCAR-NKT细胞表现出对BCMA−肿瘤细胞的杀伤增强（图7d g）。

研究者们整合了另一项临床试验中自体PBMC衍生的GD2.CAR工程化IL-15增强的NKT细胞的scRNA-seq数据与本研究的临床前动物研究中评估 Allo/15BCAR-NKT细胞产生的数据（图4），并比较了这两种CAR-NKT细胞的基因谱（图7l）。两个群体均表达混合T/NK特征、耗竭（BTG1）和细胞溶解功能（GZMH、GZMK、GZMM、LAMP1和NKG7）的基因（图7m-p）。与GD2-CAR 15 NKT细胞相比，Allo/15BCAR-NKT细胞显示出总体提高的NK基因表达（图7m n）。

讨论

为产生与临床开发相容的AlloCAR-NKT细胞，该研究提供了一种用于分化和扩增的培养系统，该系统不使用3D培养或异种饲养细胞。除了CAR，还将其他遗传元件整合到细胞中，例如编码免疫增强分子（IL-15）、安全开关（例如sr39TK）和报告基因（Fluc和EGFP）的遗传元件。这些基因的插入不会破坏细胞的生产质量和产量，这表明该技术可能广泛应用于靶向各种血癌、实体瘤和其他疾病。

该项研究中的AlloCAR-NKT细胞不含传统αβ T细胞，这降低了GvHD的风险，并实现了生产过程的简化，无需额外的纯化步骤。由于NKT细胞不能识别不匹配的HLA，因此不需要敲除内源性TCR，从而进一步增益CAR-NKT细胞。从输入HSPC到输出成熟NKT细胞实现了超过106倍的扩增，且15名不同遗传背景的脐带血供体成功用于生成CAR-NKT细胞，避免了供者选择的需要。

目前，各种同种异体细胞产品已经针对B细胞恶性肿瘤、急性髓性白血病、MM以及某些实体瘤进行了I期临床试验，但同种异体细胞产物仍然存在的一个问题是宿主细胞介导的同种异体排斥反应。该研究表明，AlloCAR-NKT细胞表现出内在的、稳定的低免疫原性表型。

该研究发现AlloCAR-NKT细胞与临床试验中PBMC衍生的GD2-CAR 15 NKT细胞具有相似的表型、功能和分子特征，这一发现证实了AlloCAR-NKT细胞疗法的临床潜力。与PBMC衍生的CAR-NKT细胞相比，AlloCAR-NKT细胞还表现出增强的NK特性，这可能有利于治疗以CAR抗原缺失或异质表达为特征的实体瘤。

研究中的AlloCAR-NKT细胞主要由CD8单阳性和/或双阴性细胞组成，而缺少可能具有特殊治疗价值的CD4单阳性细胞群。总的来说，还需要进行进一步优化和临床研究，以充分评估AlloCAR-NKT细胞作为现成癌症治疗的同种异体候选细胞的潜力。