国内首个人源化IgA1小鼠模型问世，为疾病机制探索与药物研发开辟新路径
国内首个人源化IgA1小鼠模型问世，为疾病机制探索与药物研发开辟新路径
免疫球蛋白A（IgA）肾病是世界上最常见的原发性肾小球肾炎，越来越多的证据表明半乳糖缺陷型IgA1（Gd-IgA1）与该病的发病机制相关。然而，目前却并没有揭示Gd-IgA1的来源，这使得我们对于该疾病的认知不够充分，也无法有效地进行靶向治疗。
2024年8月22日，JASN发布了来自北京大学第一医院吕继成和张宏教授团队的最新研究。该研究结合小鼠表达人源化IgA1及补体H因子突变的基因背景，经干酪乳杆菌细菌壁提取物（LCWE）和完全弗氏佐剂（CFA）黏膜刺激，首次成功构建了稳定产生Gd-IgA1的小鼠模型，这些小鼠出现多样性的系膜增生、内皮细胞增多、节段性硬化、新月体形成等病理表现，表现出血尿和蛋白尿等临床症状，与临床常见的IgA肾病类似。这些新发现将为我们深入探讨IgA肾病的发病机制提供重要线索，并有助于开发针对该病的靶向治疗药物。
专家简介
张宏教授
- 北京大学第一医院肾内科主任
- 北京大学肾脏疾病研究所副所长
- 主任医师、教授、博士生导师
- 日本冈山大学医学博士；美国耶鲁大学医学院遗传系客座研究员
- 中国医师协会肾脏内科医师分会常委
- 北京肾脏病学会副主委
- 国际肾脏病学会继续教育顾问委员会委员，临床试验促进委员会(ISN-ACT)委员、临床研究委员会(ISN-CRP)委员
- 国际IgA肾病合作组(IIGANN)专家委员会委员兼秘书长
- 发表SCI论文 200余篇，代表性 JAMA、KI、JASN、Nat Genet等
吕继成教授
- 北京大学第一医院肾内科副主任
- 北京大学教授、主任医师、博士研究生导师
- 国际IgA肾病研究联盟（IIgANN）研究科学委员会委员
- 中国医师协会循证医学专委会肾脏学组 委员兼秘书长
- 国家杰出青年基金获得者（2019）
研究设计
这是一项临床前研究，在改变小鼠的遗传背景的同时，提供适当的黏膜刺激，旨在构建一种基于“四重打击”学说的新型IgA肾病小鼠模型。
该研究采用C57BL/6J背景的基因编辑小鼠：
01 IGHA1+/+小鼠
将鼠免疫球蛋白α链基因(Igha)替换为人免疫球蛋白α1重链基因(IGHA1)获得，该小鼠不表达鼠IgA而表达人IgA1。
02 IGHA1+/+HW/R小鼠
将补体H因子点突变(W1206R)的HW/R杂合小鼠与IGHA1+/+小鼠杂交获得。
环境暴露实验
IGHA1+/+小鼠根据不同病原暴露水平分为3组，分别是无菌环境、无特定病原体环境和普通环境，观察至4月龄取材。
IgA肾病模型构建
2月龄野生型小鼠、IGHA1+/+小鼠和IGHA1+/+HW/R小鼠接受8次干酪乳杆菌细胞壁提取物（LCWE）与完全弗氏佐剂（CFA）腹腔注射刺激，并观察至8月龄取材。
本研究设立了三个主要目标，具体包括：1）确定不同环境暴露对人IgA1产生的影响；2）探讨LCWE与CFA刺激和Gd-IgA1与IgA1免疫复合物水平的关系；3）构建基于“四重打击”学说的具有病理及临床表型的IgA肾病动物模型。
研究结果
01
人源化小鼠的构建
本研究构建的IGHA1+/+小鼠在骨髓、脾、小肠、派氏结、外周血等各组织器官均表达人源性IgA1，而非鼠源性IgA。该小鼠可经抗体类别转换、体细胞高频突变产生多样性的IgA1抗体。
图1 IGHA1+/+小鼠的构建
备注：图1 A：人IGHA1、小鼠Igha和替换后基因结构图示；图1 B：用WT、IGHA1杂合及纯合小鼠和人血清免疫印迹法检测小鼠IgA和人IgA；图1C-D：小鼠的派氏结和小肠的鼠IgA和人IgA1免疫组化染色；图1 E: BCR-Seq显示小鼠的回肠组织中的免疫球蛋白亚型；图1G ：人IgA1或小鼠IgA的CDR3序列长度在IGHA1小鼠和WT小鼠中分布均匀。
02
病原体暴露与IgA1的产生
IgA是人类产生数量最多的抗体，有三种常见亚型，即单体、多聚体和含IgA的免疫复合物。三种环境暴露的小鼠均产生了IgA1（图2A），病原体暴露程度越高，则IgA1的水平越高。在普通环境下，Gd-IgA1的生成增加；无菌环境下，Gd-IgA1的生成减少，提示微生物环境对Gd-IgA1的影响（图2B）。此外，研究人员测定了不同部位（脾脏、腹股沟淋巴结、派氏结、肠系膜淋巴结）中IGHA1 mRNA表达水平，随着病原暴露增多，免疫器官和黏膜组织中的IgA1转录增加（图2C）。免疫荧光染色显示，肠黏膜产IgA1浆细胞平均荧光强度随病原暴露水平而增加（图2D-E）。
图2 不同病原体暴露水平与IGHA1+/+小鼠体内IgA1水平的差异
03
LCWE与CFA刺激和Gd-IgA1
与IgA1免疫复合物水平的关系
2月龄的小鼠开始接受8针LCWE与CFA的刺激，观察至8月龄（图3A）。经LCWE与CFA刺激后的小鼠，其Gd-IgA1水平显著增加且程度大于总IgA1水平：相比对照组，LCWE与CFA刺激后血清IgA1水平增长1倍而Gd-IgA1水平增长4倍，表明对LCWE的反应主要是Gd-IgA1的产生（图3B-D）。通过两种不同方法测定的IgA1免疫复合物水平也在增加，并持续至第八个月（图3E）。将从小鼠体内纯化的IgA1进行糖质谱检测后，明确了该小鼠分泌的IgA1铰链区可进行O糖修饰，且经LCWE与CFA刺激后，IgA1呈现半乳糖缺失的表型（图3F-H）。
图3 LCWE刺激后血清Gd-IgA1和IgA1免疫复合物水平升高
04
肠道黏膜参与Gd-IgA1的生成
LCWE与CFA诱导后，小肠粘液中的IgA1和Gd-IgA1升高（图4A），与小肠固有层IgA阳性浆细胞的增加相平行（图4B）。LCWE刺激后，回肠末端及派氏结组织中的TGFβ、BAFF、 APRIL和iNOS 的mRNA水平均显著增加（图4C-F），表明小肠固有层、派氏结、肠系膜淋巴结中T细胞依赖和非依赖的通路均参与了浆细胞分泌Gd-IgA1的过程。
图4 T细胞依赖和非依赖通路的激活参与了Gd-IgA1的分泌
05
Gd-IgA1的产生和补体系统
异常导致病理损伤与临床表型
经LCWE及CFA刺激后，IGHA1+/+小鼠及IGHA1+/+HW/R小鼠肾小球系膜区呈现IgA1和Gd-IgA1沉积，伴C3沉积（图5A-B）。IGHA1+/+小鼠及IGHA1+/+HW/R小鼠刺激后呈现多样性的肾脏病理，表现为系膜细胞增生及基质增多（12/12），毛细血管内皮增生（12/12），部分小鼠有新月体形成（IGHA1+/+：2/12；IGHA1+/+HW/R：3/12），IGHA1+/+HW/R小鼠出现节段性肾小球硬化（2/12）和肾小管萎缩/间质纤维化（3/12）（图5C-D）。在临床表型方面， IGHA1+/+HW/R小鼠具有显著的血尿和白蛋白尿表型（图5E-F），提示Gd-IgA1的产生和补体系统异常共同作用于IgA肾病的发病过程。
图5 IgA肾病模型小鼠病理损伤与临床症状
大咖点评
吕继成教授
在IgA肾病动物模型中获得的信息为我们深入理解IgA肾病的发病机制及开发靶向特异性药物提供了重要依据。在本研究中，我们成功地构建了一个表达人源化IgA1并具有完整的O-糖基化铰链区的IGHA1小鼠模型。在LCWE和CFA的刺激下，IGHA1小鼠的病理损伤状况和临床中常见的IgA肾病患者表现出更高的相似性。既往模型常用小鼠模型，如野生型小鼠则仅表现出系膜病变。此外，在该模型中，大量的Gd-IgA1产生于黏膜并进入循环系统，最终形成免疫复合物，这进一步支持了“多重打击”的理论。总之，我们这个研究的重要进步便是开发了IGHA1小鼠模型，这种更贴近于临床/人体IgA肾病的动物模型，可以有助于IgA肾病的未来研究。
张宏教授
本研究表明，人源化IgA在IGHA1小鼠中的功能和作用与菌群和炎症反应相关，再一次提示了黏膜免疫在IgA肾病中的重要性。人源化IgA肾病模型的研究提示，暴露于食物和/或微生物抗原的小鼠模型中，黏膜多聚IgA的过度生成是导致IgA肾病的重要因素。与无菌环境的小鼠相比，正常环境中的小鼠表现出更强的免疫反应。此外，LCWE和CFA刺激后小鼠的黏膜来源Gd-IgA1水平显著增加，表明该模型适用于研究“黏膜-肾轴”在IgA肾病中的作用。
总的来说，我们建立了一种新型的IgA肾病小鼠模型，研究了Gd-IgA1的来源及其对肾脏病理损伤的影响。未来，该动物模型将有助于探索遗传、环境因素和Gd-IgA1导致IgA肾病的机制，并为开发新的靶向治疗策略提供基础。
- Li R, Wang M, Li J, et al. Lactobacillus casei Cell Wall Extract and Production of Galactose-Deficient IgA1 in a Humanized IGHA1 Mouse Model. J Am Soc Nephrol. 2024 Aug 22.