寡核苷酸药物的血浆蛋白结合研究——意义、方法和策略
寡核苷酸药物的血浆蛋白结合研究——意义、方法和策略
寡核苷酸药物是近年来药物研发领域的热门方向，主要包括反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）。这些短的DNA或RNA分子通过调节基因表达，为多种疾病提供靶向治疗方案。在寡核苷酸药物的临床前开发中，血浆蛋白结合研究是一个重要环节，它不仅影响药物的体内分布、代谢和排泄，还关系到药物的安全性和有效性。本文将从蛋白结合对药物性能的影响、具体研究方法及其优缺点等方面，对寡核苷酸药物的血浆蛋白结合研究进行深入探讨。
一、蛋白结合对小分子药物性能的影响
血浆蛋白结合率（plasma protein binding, PPB）是指药物与血液或血浆内蛋白的结合程度。在药理学中，药物以两种形式存在：未结合型及结合型。未结合的药物分子可穿过细胞膜扩散，到达其作用部位并被消除。相比之下，与血浆蛋白结合的药物大部分保留在血管腔内，提供了可保留的药物储库，随着游离药物浓度下降，结合的药物被释放到循环中（图1）。
结合与未结合药物之间的平衡在小分子药物研发中的意义十分重大，这与被普遍认可的“游离药物假说”密切相关。该假说由两部分组成：(i) 作用部位的游离药物浓度是驱动药理作用的主要因素。(ii) 在稳态状况下，对于非摄取或外排转运蛋白底物的药物，任何生物膜两侧的游离药物浓度是相同的[1,2] 。其中第二部分对于理解小分子药物，特别是调节胞内靶点的药物的PK/PD尤为重要。因此，PPB是小分子药物研发中常规测定的一种关键参数，用于建立PK/PD关系、种属间的参数换算，以及计算药物的治疗指数。
图1. 药物在血液和多种器官之间的平衡[3]
二、蛋白结合对ASO性能的影响
ASO与蛋白的结合也可以影响其许多方面的性能，包括组织分布和组织递送、细胞摄取、细胞内转运、药效和毒性[4]。ASO的血浆蛋白结合会极大地影响其系统清除，尤其是肾脏清除[5]，而与细胞表面蛋白的结合可以调节ASO的细胞摄取能力。另一方面，与组织细胞内的蛋白结合也对ASO的组织半衰期有较大影响。
ASO的亲水性和序列特征可以影响它的蛋白结合程度及结合速度。低蛋白结合的ASO，其细胞摄取能力也比较低，且肾清除率较高。例如，吗啉环（PMO）修饰的ASO，通过引入吗啉环、排除磷酸二酯键增加了亲水性。它们的血浆蛋白结合率通常为40%或更低，明显低于硫代磷酸酯（PS）修饰的ASO。由于亲水性增加，他们主要的排泄途径是通过尿和粪排泄。相反，高蛋白结合的ASO，如PS-ASO，研究人员通过增加亲脂性和对核酸酶的耐受性，提高裸核酸的成药性。它们往往具有较高但非特异性的细胞摄取，在组织中的保留时间长，并因此可能产生一些安全问题。
人们发现与ASO结合的血浆蛋白种类已有三十年了，但目前人们仍然不能完全理解ASO-蛋白相互作用的机制及对细胞摄取和生物分布的影响[6]。在一项研究中，一个与血浆蛋白具有高亲和力、特异性结合的ASO，其蛋白结合直接影响了在α 2巨球蛋白基因敲除小鼠中的药效[7]。从循环中去除这个蛋白后导致ASO的活性显著增加，表明与蛋白结合可以调节ASO分流至非生产性途径，同时这可能与ASO在周围组织的分布过程发生改变有关。但目前并不提倡通过结构修饰来优化ASO蛋白结合特性，因此人们也在尝试多种其他技术，如偶联技术来增强细胞摄取或提高对特定组织的靶向选择性。与一些亲脂性强的基团偶联后的ASO[8,9]有更强的血浆蛋白结合能力，并导致更强的细胞摄取。
ASO的组织分布特征一般是在肾脏，肝脏，脾脏，淋巴结、脂肪细胞和骨髓中的浓度较高[10,11]。它们的组织分布不仅取决于血流/灌注，同时也受蛋白结合特性的影响[12]。ASO的化学修饰可导致其分布模式的显著差异，部分原因也是由于它们的蛋白结合能力发生了改变[13-15]。总之，与血浆和细胞蛋白的结合对于ASO在体内的作用持久性、组织分布和细胞摄取至关重要。
三、蛋白结合对GalNAc-siRNA性能的影响
对于GalNAc-siRNA，与血浆蛋白结合的药理作用及对PK和药效的影响在目前尚未有明确报道。在一项研究中，研究人员发现很大比例的GalNAc-siRNA和血清蛋白发生了结合，但血清蛋白结合对GalNAc-siRNA在原代人肝细胞中的摄取和活性没有产生影响[16]。血浆中游离siRNA的浓度与它们的药效之间未发现直接关联，且与血浆蛋白结合似乎并没有保护inclisiran在肾小球的滤过率。但随着GalNAc-siRNA化学技术的不断发展，未来的GalNAc-siRNA不一定会表现出同样情况，相关研究领域的专家主张继续对血浆PPB和血液PK之间的关系进行监测[17]，因为GalNAc-siRNA结合蛋白或结合亲和力的变化会导致siRNA分布和暴露量发生改变。此外，对血液分布过程的深入理解，包括血浆结合蛋白的种类和结合程度，有利于确立肝外递送的研究策略。关于siRNA PPB是否为新药申报所必须包含的部分，建议当 siRNA 包含新的化学修饰、连接体、配体、赋形剂，或尚未在临床批准的药物中进行检测的制剂时，或者有理由认为血浆游离药物浓度可以影响PK、PD和/或安全性，siRNA的PPB报告应纳入申报资料中（图2）。
图2. 新药申报的角度的siRNA PPB研究决策树[18]
四、寡核苷酸药物的蛋白结合测定方法
ASO和siRNA的理化性质与小分子药物有明显差异，尤其在分子量、形状和表面电荷方面，因此，直接应用小分子PPB的方法测定寡核苷酸会出现一些问题。测定 PPB 时需要解决的主要问题是非特异性结合（NSB）。寡核苷酸可以非特异性地与实验室耗材（如微孔板和吸头）结合，严重的NSB会导致结果不准确。可以采用不同的方案，如低吸附耗材和预处理步骤，以尽量减少 NSB，详细的降低NSB的方案可参考我们已发布的文章：非特异性吸附的产生和解决策略解析。目前已报道的蛋白结合测定方法中，ASO有超滤法[19,20]和超速离心法[21]，siRNA主要有超滤法[22]和电泳迁移法23。这些方法都有一定的局限性，如成本、通量和回收率的限制。以下我们对其中两种方法的优势和局限性进行介绍。
EMSA法
由于简单、快速和低成本，EMSA成为研究蛋白质与DNA或RNA之间相互作用最常用的方法之一。典型的EMSA实验通常使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 或琼脂糖凝胶电泳，从结合复合物中分离游离的核酸。聚丙烯酰胺凝胶历来被使用的更多，是因为其对相对较小的核酸具有更高的分辨率[24]。琼脂糖凝胶的EMSA在过去通常局限于分离较大的核酸，为了提高寡核苷酸的分辨率，研究人员采用了多种方法，包括提高琼脂糖百分比、改变运行缓冲液、提高电压等[25]。改进后的方法可以用更短的运行时间（<10 min）实现更快速的分离，减少了核酸在凝胶中的扩散，获得更清晰的条带，同时降低了蛋白结合复合物解离的机会，这是非平衡核酸结合实验中的一个重要关注点。EMSA法需要关注的地方：在凝胶上样时样品需要用专门的上样溶液对血浆进行稀释，蛋白结合率的准确度是否会受到稀释液的组成成分的影响，以及稀释效应的影响。此外，核酸的染色在较宽的浓度范围内并不呈线性关系[26]。如图3为我们实验室中几个寡核苷酸化合物的浓度与琼脂糖凝胶电泳（E-Gel™ Power Snap电泳仪）上样品条带灰度值的最佳拟合线，不同的化合物呈现出半对数线性关系（A），或对数线性关系（B）。
图3. 几个寡核苷酸化合物的浓度和琼脂糖凝胶电泳（E-Gel™ Power Snap电泳仪）灰度值的最佳拟合线，不同的化合物呈现出半对数线性关系（A），或对数线性关系（B）。
超滤法
超滤法的一个优势是可以在纯血浆中进行实验，不必采用稀释血浆，同时保证实验过程中体系的pH接近于生理pH值。将超滤管用去污剂进行预处理后，可实现较低的非特异性结合。超滤法需要关注的地方：如果siRNA分子大小接近50 kD超滤管过滤器的截留分子量上限，较长的siRNA，或配体体积较大的siRNA可能会出现回收率偏低的现象。另外，可能出现蛋白渗漏现象，任何流体动力学半径小于过滤膜孔径的物种都可以通过滤膜，因此，在理论上，如果寡核苷酸与小分子量的蛋白发生结合且通过了滤膜，则PPB与真实值会出现偏差。
表1展示的是我们实验室用超速离心法和超滤法测定的几个ASO化合物在PBST（添加了Tween-20的磷酸钠缓冲液）中的游离率，以评估超速离心法的离心沉降率和超滤法的膜透过率。这几个化合物在超滤法中的游离率和回收率较高，表明非特异性吸附可以被忽略。超速离心法得到的游离率偏低，表明游离的分子在缓冲液中存在一定的沉降。表2为我们实验室用超率法测定的血浆蛋白渗漏率，超滤液中的蛋白含量通过BCA法进行测定。超滤法的实验条件需经过优化，确保蛋白渗漏率最低。
表1. 超速离心法和超滤法比较几个ASO化合物在PBST中的游离率
表2. 超率法测定血浆蛋白渗漏率
结语
在过去的几年中，研究者们在理解寡核苷酸-蛋白相互作用的性质和重要性方面取得了重大进展，特别是在PS修饰的ASO领域，包括与PS修饰的ASO 结合的蛋白种类、蛋白相互作用对ASO性能的影响以及PS-ASO结构修饰和蛋白相互作用的构效关系。对这些相互作用的深入了解有助于设计更加安全有效的ASO药物。与此同时也产生了更多亟待解决的问题，如能否开发增强亚细胞分布的药物化学解决方案？什么类型的配体可以促进靶向递送到组织，如骨骼肌？相信人们未来的研究可以回答这些问题。此外，对于siRNA，尽管目前已报道的相关研究仍然较少，我们期待未来的研究可以帮助我们更好的揭示蛋白结合(包含血浆、组织等) 在解读PK-PD关系中的作用。