多组学时代：探索转录组、蛋白组和代谢组的联合分析

多组学时代：探索转录组、蛋白组和代谢组的联合分析

随着生命科学研究的不断深入，多组学技术已成为揭示复杂疾病机制的重要工具。通过整合基因组、转录组、蛋白组和代谢组等多层次数据，研究人员能够更全面地理解疾病的发生发展过程。本文以冠心病痰瘀证为例，展示了多组学联合分析在疾病研究中的应用价值。

在过去几十年中，组学技术已广泛应用于生命科学和医学基础研究。随着研究深入和技术进步，临床基础科研正逐步步入多组学时代。这些技术被广泛运用于肝癌、前列腺癌、心血管疾病、肠道炎症性疾病、慢性肾病和中风等多种疾病的研究中。传统的单一组学难以全面系统地解析复杂生理过程的调控机制，而多组学研究能够从基因、转录、蛋白质和代谢等多个水平全面研究，相互验证，减少了单一组学分析的局限性和假阳性。这有助于建立机体调控网络，深入阐述各分子水平之间的调控关系和因果关系。一些上游组学研究能揭示上游基因表达与转录层面的相关性，但要深入了解代谢物表征的表型上的变化受到哪些基因的调控，就需要将转录组学、蛋白质组学与下游的代谢组学相互关联。这种综合分析有助于系统描绘蛋白至代谢的调控过程，挖掘关键蛋白与代谢物上下游调控通路，揭示表型与基因型之间的关联，从而研究代谢特征的上游调控机制。接下来，我们将带领大家精读一篇文献深入探讨如何联合转录组学、蛋白质组学和代谢组学。

案例分析

研究概况

根据中医理论，痰瘀是冠心病的病理基础。本研究旨在探讨冠心病PBS综合征的生物学基础。使用在90个临床样本上整合RNA-seq、基于DIA的蛋白质组学和非靶向代谢组学的策略，我们构建了CHD-PBS综合征的“基因-蛋白质-代谢产物”网络。后续我们扩大了样本量，并通过酶联免疫吸附测定验证了网络中的差异基因和代谢物。研究结果显示，CHD-PBS综合征的“基因-蛋白质-代谢产物”网络包括33个mRNA、4个蛋白质和25个代谢产物。在测序阶段，JNK1、FOS、CCL2、CXCL8、PTGS2和CSF1在PBS组中均低表达，而花生四烯酸（AA）高表达。在验证阶段，JNK1、AP-1、CCL2和CXCL8表达较差，而PTGS2、CSF1和AA表达较高。

测序策略

RNA-seq；基于DIA的蛋白质组学；非靶向代谢组学

样本信息

90个临床血液样本

研究过程及结果

研究者收集了健康受试者以及患有PBS和无痰血瘀症（NPBS）的CHD患者的血液样本，通过对样本进行转录组、蛋白质组和代谢组学分析来比较它们之间的差异。生物信息学分析确定了差异的分子以及相关的生物过程和途径。

接下来，使用MetaboAnalyst数据库、String数据库和Cytoscape软件构建“基因-蛋白质-代谢物”网络。研究者选择了具有强中心性和生物关联性的分子作为潜在的PBS综合征生物标志物，并招募了更多的志愿者通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行进一步验证。最后，利用ROC曲线来评估各种分子的水平和诊断功效。

图1 PBS综合征的多组学综合策略流程图

（1）冠心病患者痰血瘀证或非痰血瘀证的临床特点

我们分别评估了疾病、年龄和性别对转录组、蛋白质组和代谢组表达的影响。选取前1000个基因、代谢物和所有蛋白质进行主成分分析。结果显示，疾病状态和年龄是导致转录组、蛋白质组和代谢组变化的主要因素(图2A-F)。显然，CHD-PBS综合征患者、CHD-NPBS综合征患者和健康成人在mrna、蛋白质和代谢物的表达上存在显著差异。在接下来的研究中，我们将定量描述这种差异，并确定不同组学之间的关联。

图2 不同临床特征的主成分分析。(A-C)疾病、年龄和性别对转录组表达的影响。(D-F)疾病、年龄和性别对蛋白质组表达的影响。(G-I)疾病、年龄和性别对代谢组表达的影响。

（2）CHD-PBS综合征的转录组学特征

在转录组学研究中，我们确定了CHDPBS综合征的DG。首先，为了鉴定DG，我们进行了基于计数的DG表达分析。在CHD和HC组之间总共鉴定了288个DG，其中184个DG上调，104个DG下调（图3A）。热图显示CHD组和HC组之间基因表达的显著差异（图3B）。在总结上述三组的富集结果时，我们发现PBS综合征的DG在TNF信号传导途径、磷脂酶D信号传导途径和AA代谢中富集（图3C）。为了进一步研究这两种综合征患者中表达的核心基因，我们进行了基因-基因相互作用的网络分析。PBS综合征的一些中枢基因是FOS、PDGFRB、PWP 2、BMP 2和EGFR 1（图3D），而NPBS综合征的中枢基因是FOS、CDKN 1A、HIF和NFKBIA（图3E）。

图3 冠心病- pbs综合征的转录组学特征。(A)各组差异表达基因数量。(B) CHD组和HC组差异基因热图。(C)不同组KEGG通路的比较。(D) CHDPBS综合征的基因-基因相互作用网络。(E)冠心病- npbs综合征的基因-基因相互作用网络。

（3）CHD-PBS综合征的蛋白组学特征

接下来，我们进行了基于DIA的蛋白质组学分析，以探索PBS综合征和健康成年人之间蛋白质丰度的差异。用DIA方法在18名受试者的血浆中总共发现了3690个多肽和324个蛋白质。蛋白质的相对丰度跨越了五个数量级。载脂蛋白A-I(APOA1)的蛋白表达水平最高，而鼻咽癌细胞内胆固醇转运蛋白2的蛋白表达水平最低(图4A)。根据DP表达分析，与HC组相比，CHD组有23个血浆蛋白上调，32个血浆蛋白下调。PBS综合征组有41个DPS，其中16个DPS上调，25个DPS下调。与HC组相比，NPBS综合征组共发现46个DPS，其中14个DPS上调，32个DPS下调。此外，在PBS和NPBS组之间发现了13个DP，其中6个上调，7个下调(图4B)。两种症候的血浆蛋白质组与转录组差异不大。GO注释分析显示，PBS综合征的DPS丰富了补体激活、血小板脱颗粒、体液免疫反应、吞噬、受体介导的内吞、经典途径和免疫球蛋白介导的免疫反应等生物学过程(图4C)。接下来，我们确定了CHD两个症型之间的蛋白质差异。根据PPI网络和对核心蛋白生物学功能的分析，PBS综合征表达的蛋白质主要与凝血和脂代谢有关(图4D)，而NPBS综合征表达的蛋白质主要与凝血、脂代谢和炎症有关(图4E)。

图4 冠心病伴PBS综合征患者的蛋白质组学特征。(A)蛋白质的相对丰度跨越五个数量级。(B)各组差异蛋白的数量。(C) CHD-PBS综合征患者差异蛋白的GO富集分析。(D)冠心病- pbs综合征患者差异蛋白的蛋白相互作用分析。(E)冠心病- npbs综合征患者差异蛋白的蛋白-蛋白相互作用分析。

（4）CHD-PBS综合征的代谢组学特征

然后，我们通过UPLC/MS使用从患者和健康受试者收集的正离子和负离子扫描数据研究了CHD-PBS综合征的血清代谢组学特征，总共发现了17，890种代谢物，其中1385种在HDMB数据库中进行了注释。我们通过SIMCA软件的OPLSDA分析生成DM，筛选标准为VIP >1和adj. p值< 0.05。与HC组相比，CHDPBS和CHD-NPBS组中分别改变了130种（99种上调和31种下调的DM）和122种（90种上调和32种下调的DM）代谢物（图5A）。OPLS-DA评分和聚类热图显示PBS、NPBS和HC组表现出明显的分离趋势，而PBS和NPBS组有些重叠（图5 B、C）。通过代谢物类型区分两种综合征，我们发现PBS组表现出更多的脂质趋势（图5D）。接下来，我们使用MetaboAnalyst平台进行功能富集分析。鉴定了与PBS综合征相关的几种代谢途径（p值< 0.05），包括色氨酸代谢、甘油磷脂代谢、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、类固醇激素生物合成和嘌呤代谢（图5E）。为了进一步理解代谢物、其种类和富集途径之间的关系，我们使用Cytoscape软件编辑了结果。脂质和脂质样分子、有机酸及其衍生物和有机杂环化合物是参与PBS综合征患者中观察到的代谢失衡的这些代谢物的主要种类，如图5 F所示。

图5 伴有PBS综合征的冠心病患者代谢组学特征(A)各组差异代谢物数量。(B)三组OPLS-DA分析。(C)三组聚类热图分析。(D)不同证候的代谢物类型。(E) PBS综合征鉴别dm的功能富集分析。(F)代谢物、物种和富集途径的网络关系。

（5）DG、DPS和DM的集成分析

通过整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据，我们为这两种综合征建立了“基因-蛋白质-代谢物”网络。pbs综合征的多组学网络由33个mrna、4个蛋白和25个代谢物组成(图6A)，而NPBS综合征的多组学网络由64个mrna、9个蛋白和23个代谢物组成(图6B)。对两个网络进行KEGG富集分析发现，PBS综合征网络中的分子在IL-17信号通路、类风湿关节炎、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、恰加斯病、TNF信号通路、疟疾、脂质和动脉粥样硬化、AA代谢等方面富集(q值> 0.05)。NPBS综合征网络中的分子仅在神经活性配体-受体相互作用中富集(q值> 0.05)(图6C)。最后，我们寻找PBS综合征的关键靶点。根据KEGG富集结果，PBS综合征与IL-17信号通路和AA代谢密切相关。一些DGs编码MAPK信号通路的以下关键分子，它们位于IL-17通路的下游:FOS(图6E中的AP-1)、CCL2、CXCL8、CXCL1、CXCL2和PTGS2。在dg和dm中，AA、PTGS2、ALOX15B、PTGDS和AKR1C3是AA代谢的底物和关键酶(图6F)。此外，根据分子的度和间距对网络中的分子进行排序。因此，由于生物学关联和统计学关联，我们进一步验证了AA、AP-1、PTGS2、CCL2和CXCL8是PBS综合征的潜在靶点(图6D)。

图6 转录组-蛋白质组-代谢组整合分析和潜在靶点。(A) PBS综合征差异基因、蛋白和代谢物的网络分析。(B) NPBS综合征差异基因、蛋白和代谢物的网络分析。(C)两证网的KEGG富集分析。(D) IL-17信号通路。(E)花生四烯酸代谢。(F) JNK-FOS-AP-1通路。

（6）酶联免疫吸附试验验证

根据多组学网络结果，PBS综合征的中心基因和代谢物为AP-1 (FOS)、CCL2、CXCL8、PTGS2和AA。这些基因表现出上下调控关系，并与MAPK通路相关(图7A)。FOS家族是转录因子AP-1的一个亚基。活化的JNK磷酸化FOS并最终激活AP-1。此外，在我们的转录组学研究中，AP-1的下游分子CSF1存在差异表达。基于上述生物学联系，通过扩大样本量，选择AA、JNK1、AP-1、CCL2、PTGS2、CXCL8和CSF1作为最终验证的候选分子。在测序阶段，PBS组JNK1、FOS、CCL2、CXCL8、PTGS2和CSF1的表达量较低，而AA的表达量较高(图7c - 1)。在验证阶段，PBS组JNK1、AP-1、CCL2和CXCL8的表达较低，ptgs2、CSF1和AA的表达较高(图7J-P)。除AA外，其余指标均有统计学意义(p < 0.05)。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估JNK1、AP-1、CCL2、CXCL8和CSF1;这些都是通过大样本量来验证的。曲线下面积(AUC)越大，诊断价值越高。各分子的AUC为:CSF1 [0.9635, 95%CI (0.9295, 0.9976)] > JNK1 [0.9361, 95%CI (0.8749, 0.9972)] > CXCL8 [0.8953, 95%CI (0.8222, 0.9684)] > CCL2 [0.8458, 95%CI (0.7676, 0.9241)] > AP-1 0.7884, 95%CI(0.6869, 0.8899)。基于CSF1和JNK1进行Logistic回归分析，回归方程为:p = 1/[1 e−(0.042×CSF1-0.008×JNK1-2.146)]。该logistic模型的AUC为0.992。同时检测CSF1和JNK1对PBS综合征的诊断价值和意义最高。结合ROC曲线的特异度和敏感性计算约登指数。以最大约登指数对应的临界值为最佳诊断点。CSF1、JNK、CXCL8、CCL2、AP-1的最佳诊断点分别为286.6、992.7、1479、29.78、166.8 pg/ml。

图7 酶联免疫吸附试验验证。(A) JNK/AP-1通路与AA代谢。(B)不同分子的ROC曲线。(c - 1) JNK1、FOS、CCL2、CXCL8、PTGS2、CSF1、AA的RNA-seq结果。(J-P) JNK1、AP-1、CCL2、CXCL8、PTGS2、CSF1、AA的ELISA结果。

结 语

通过将临床样本与多组学研究相结合，上述研究发现:1)冠心病- pbs综合征的“基因-蛋白-代谢物”网络包括至少33种mrna、4种蛋白和25种代谢物。2) aa代谢紊乱和JNK/ AP-1通路抑制可能是PBS综合征的特征。3) PBS综合征FOS、AP-1、CCL2、CXCL8、JNK1水平降低，PTGS2、CSF1水平升高。4) CHD-PBS综合征的诊断标志物包括CSF1 (>286.6 pg/ml)、PTGS2 (>992.7 pg/ml)和CXCL8 (>1479 pg/ml)。

由此可见，综合转录组学、蛋白质组学和代谢组学的联合分析，有助于揭示疾病与哪些功能通路相关，并为诊断标志物的发现提供可靠依据。

参考文献
【1】Yang, G., Zhou, S., He, H., Shen, Z., Liu, Y., Hu, J., & Wang, J. (2022). Exploring the "gene-protein-metabolite" network of coronary heart disease with phlegm and blood stasis syndrome by integrated multi-omics strategy. Frontiers in pharmacology, 13, 1022627. https://doi.org/10.3389/fphar.2022.1022627IF: 5.6 Q1