游离胎儿DNA检测（NIPT）及其与产前指标的相关性
游离胎儿DNA检测（NIPT）及其与产前指标的相关性
无创产前检测（NIPT）是一种通过检测母体血液中的游离胎儿DNA（cffDNA）来筛查胎儿染色体异常的技术。近年来，随着高通量测序技术的发展，NIPT在产前筛查中的应用越来越广泛。本文基于对中国中部地区14316名孕妇的回顾性分析，探讨了cffDNA全基因组测序在产前筛查中的临床意义。
背景知识
游离胎儿DNA（cffDNA）产前检测，又称无创产前检测（NIPT），因其高灵敏度和特异性，成为血清学筛查和侵入性检测的有吸引力的替代方法。目前，NIPT主要用于筛查21三体、18三体和13三体等高危妊娠。然而，由于血浆中的cffDNA主要来源于胎盘滋养层细胞，其检测结果可能与超声检查和/或胎儿实际染色体组成不一致。
此外，许多因素可能导致NIPT检测出现假阳性，包括母体染色体异常、母体肿瘤（霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等）、消失的双胎、胎盘局限性胎盘嵌合体（CPM），甚至胎盘嵌合现象。到目前为止，NIPT一直被用作筛查方法，而不是诊断测试；它不能取代绒毛膜绒毛取样和羊膜穿刺术等侵入性诊断方法。
目前应用最广泛的两种NIPT方法是单核苷酸多态性（SNP）检测法和全基因组测序（WGS）法。这两种方法在检测常见非整倍体（T21、T18、T13和X单体）方面具有相当的临床灵敏度。在本研究中，通过分析来自中国中部地区孕妇的14316份血浆cffDNA WGS筛查数据，探讨NIPT筛查作为一种有用的产前筛查工具，在实现高质量孕期护理方面的临床意义。论文作者研究了NIPT与产前检测指征的相关性，特别是其在检测21三体、18三体、13三体、性染色体非整倍体（SCA）、非21/18/13常染色体非整倍体和CNV异常方面的灵敏度和特异性。我们还分析了NIPT结果出现假阳性和假阴性的可能原因。
方法
数据来源：2013年10月至2018年11月，武汉大学人民医院共纳入14316名孕妇。对14316名有产前检测指征的孕妇进行回顾性分析，这些指征包括高龄产妇（≥35岁）、母体血清筛查异常、颈项透明层增厚（≥2.5mm）、其他超声异常、双胎妊娠/体外受精-胚胎移植（IVF-ET）妊娠等。本研究采用母体血浆cffDNA全基因组测序（WGS）技术。
cffDNA的制备和测序
采集5ml母体外周血于EDTA管中，充分混匀后暂时储存在4°C冰箱中。若发生溶血或在血浆分离前样本储存超过8小时，则排除该样本。通过在4°C、1600×g条件下离心血液样本10分钟，分离血浆并分装至2.0mL Eppendorf管中。所得血浆在4°C、16000×g条件下再次离心10分钟。小心地将上清液以600μL每份分装到新的2.0mL Eppendorf管中，并储存在-80°C用于cffDNA提取。使用NucleoMag cfDNA分离试剂盒（中国北京Takara公司）按照制造商的说明书进行血浆cffDNA提取。使用胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）检测试剂盒（中国北京博奥生物有限公司）进行文库构建、质量控制和文库扩增。按照制造商的说明，使用BioelectronSeq 4000半导体测序系统（中国北京博奥生物有限公司）对所得文库进行测序。
结果
共检测出189例（1.32%）NIPT阳性病例，其中113例（59.79%）经侵入性产前检测确诊。血清学筛查异常（53.14%）是最常见的检测指征，其次是高龄妊娠（23.02%）。
NIPT对21三体（T21）、18三体（T18）、13三体（T13）、性染色体异常、其他常染色体非整倍体异常和拷贝数变异（CNV）异常的阳性预测值分别为91.84%、68.75%、37.50%、66.67%、14.29%和6.45%。
在各种产前筛查指征中，颈项透明层（NT）增厚组的阳性率和真阳性率最高（分别为4.17%和3.33%），其次是自愿检测组（分别为3.49%和1.90%）。cffDNA浓度与孕周（≥10周）和NIPT阳性组的Z评分呈线性相关。
cffDNA全基因组测序对T21具有极高的灵敏度和特异性，对T18、性染色体异常和T13具有较高的灵敏度。它还为其他异常染色体核型（CNV和非21/18/13常染色体非整倍体异常）提供了证据。cffDNA浓度与孕周密切相关，并决定了NIPT的特异性。结果强调了NIPT的临床意义，它是实现高质量孕期护理的有效产前筛查工具。
孕妇的年龄和孕周分布
将孕妇按5岁间隔分为8个年龄组。不同年龄组的孕妇人数见图1A。数据显示，中国中部地区分娩的孕妇主力军年龄在25-40岁之间；阳性检测病例也集中在该年龄组，占所有阳性病例的52.43%（97/185）（图1C）。最常进行检测的时间是在孕16周和22周。阳性病例的孕周分布见图1B和1D。
游离胎儿DNA浓度与孕周及21三体、18三体、13三体Z评分的关系
cffDNA浓度是胎儿非整倍体检测中众所周知的关键因素。作者进一步研究了cffDNA浓度及其与孕周和Z评分的关系。测量了5656份血浆样本中的cffDNA，并将近80份NIPT检测为21三体、18三体、13三体阳性样本的cffDNA浓度与Z评分进行关联分析。结果表明，cffDNA含量随孕周显著增加（图2A）。二者具有显著的正相关性，但相关系数仅为0.6971，这表明孕周可能与其他机制共同影响cffDNA浓度。对cffDNA浓度与NIPT阳性样本Z评分的相关性进一步研究发现，cffDNA浓度随21三体、18三体、13三体的Z评分显著增加，相关系数分别为0.744、0.2727和0.4338（图2）。
21三体、18三体、13三体的NIPT检测结果
在14316名孕妇中，共发现189例NIPT染色体异常阳性病例（表2）。单胎妊娠和双胎妊娠的阳性检出率没有显著差异（183/13162与6/458，P>0.05）。
49名孕妇检测出T21阳性（0.34%），其中1名孕妇同时伴有T13阳性。48名患者（97.96%，48/49）接受了介入性产前诊断，45例被确诊。进一步分析3例假阳性病例发现，其Z评分<5，根据试剂盒说明书判断为灰色区域。在确诊病例中，2例Z值<5，羊膜穿刺术显示为21三体嵌合核型（分别为47,XN,+21/46,XN和47,XN,+21/46,XN）。此外，还有1例漏诊T21的病例。该孕妇因超声筛查异常被召回并进行T21产前诊断。采集该孕妇外周血进行NIPT检测，结果仍为阴性；可能的解释是母体胎盘的遗传信息与胎儿不一致。
NIPT报告16例T18阳性（0.11%），其中13例（81.25%，13/16）接受了产前诊断。其中11例确诊，2例为Z值<5的假阳性病例。3例患者未进行介入性产前诊断，1例胎儿患有多发性肿瘤，1例进行了人工流产，1例发生了自然流产。
NIPT报告16例T13阳性（0.11%）。12例患者（75%，12/16）接受了产前诊断，6例确诊。4例患者未进行介入性产前诊断。1例经B超证实有多发畸形。另外3例拒绝任何形式的确诊检查并选择继续妊娠。在后续12个月的随访中未发现异常，出生后6个月内也未发现异常。统计结果见表2。
这些数据表明，NIPT对T21、T18和T13的阳性预测值分别为91.84%、68.75%和37.5%（表2）。
性染色体非整倍体的NIPT检测结果
NIPT报告63例（0.44%）性染色体非整倍体（SCA）异常，包括29例45,X、16例47,XXY、9例47,XXX和9例47,XYY。44例患者（69.84%，44/63）接受了产前诊断，42例确诊（19例X单体、3例部分X单体、8例47,XXY、2例47,XXX、1例47,XXX/46,XX嵌合体和5例47,XYY）。2例假阳性病例是由于母亲染色体异常（47,XXX）导致的。
NIPT对性染色体数目异常的阳性预测值为66.67%（42/63）。其中，XO的阳性预测值最高，为75.86%（22/29），其次是XYY和XXY（分别为55.56%和50.0%），XXX最低（33.33%）。
产前检测指征与NIPT结果
14316名孕妇进行NIPT的临床指征见表1。母体血清筛查异常（aMSS）组是最常见的指征，占比53.14%，其次是高龄产妇（AMA）组（23.02%）和自愿检测组（17.63%）。颈项透明层（NT）增厚组的阳性检出率最高（4.17%），自愿检测组次之（3.49%）。NIPT在不同指征组以及不同指征的阳性病例中，检测能力存在差异。
双胎/体外受精-胚胎移植（IVF-ET）妊娠组的阳性预测值最高，其次是颈项透明层增厚组，胎儿和胎盘其他超声异常组的阳性预测值最低。阳性预测值最低可能与阳性病例较少以及孕妇拒绝产前诊断有关。不同指征组中21三体、18三体、13三体和性染色体异常的检出率相似，差异无统计学意义（p>0.05）。
英文缩写：cffDNA：游离胎儿DNA；NIPT：无创产前检测；CNV：拷贝数变异；NT：颈项透明层；CPM：局限性胎盘嵌合体；SCA：性染色体非整倍体；AMA：高龄产妇；aMSS：母体血清筛查异常；aUS：超声异常发现；BMI：体重指数。
结论
作为一种强大的筛查方法，NIPT极大地改变了当前产前筛查的现状。随着NIPT技术在低风险妊娠人群中的普及以及高通量测序技术的发展，NIPT检测的受益人群和疾病检测范围也在不断扩大。全基因组测序NIPT通常会获得阳性结果，这些结果可能与胎儿、胎盘和/或孕妇的生物学异常有关。在进一步临床检测前，应更加重视遗传咨询和产前诊断。
回顾性数据分析表明cffDNA全基因组测序对T21具有极高的灵敏度和特异性，对T18、性染色体异常和T13具有较高的灵敏度。NIPT还为其他异常染色体核型（CNV和非21/18/13常染色体非整倍体异常）提供了证据。cffDNA浓度与孕周密切相关，并决定了NIPT的特异性。