浅谈发酵后蛋白的分离纯化技术

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浅谈发酵后蛋白的分离纯化技术

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http://www.anytesting.com/news/1950467.html

蛋白质的分离纯化是生物工程下游技术的重要环节，通过该技术可以从混合物中分离出所需的目的蛋白质。随着生物技术的发展，越来越多的蛋白质及多肽链被制造出来，因此，掌握蛋白质的分离纯化技术对于生物化学研究和应用具有重要意义。

蛋白质分离纯化的一般步骤

1. 材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，需要根据蛋白表达的方式对其进行预处理。对于胞内表达的蛋白，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。因此要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法如下：

研钵和研杵：研磨破壁法通常是将植物组织样本放在置于冷冻液氮中，通过组织研磨器的研磨来完成的。当组织材料被破坏时，可以通过添加溶剂来提取代谢物。
珠磨法：珠磨法是指在等量的细胞悬液和涡旋混合器中加入玻璃珠或磁珠用于通过固体剪切的作用来使细胞裂解的方法。这种细胞裂解法的机械剪切力足够温和，可以保持细胞器的完整性，具有较高的细胞破碎率可大规模使用，适用于各种细胞破碎。缺点是：大分子内容物较易失活，并且浆液分离较为困难。
超声波破碎仪：超声波均质器的工作原理是在浸入细胞溶液中的钛探针中引起振动。发生称为空化的过程，其中微小气泡形成并爆炸，产生局部冲击波并通过压力变化破坏细胞壁。这种方法非常适用于植物和真菌细胞，但有一个缺点：噪音较大，所以使用时，必须在额外的房间内进行。
均质机破碎法：均质器在细胞上使用类似于珠法的剪切力。可以通过将细胞挤压到比它们略小的管子中来进行均质化，从而剪掉外层（法压）或使用搅拌机中的旋转刀片（转子-定子处理器）。
冷冻破碎法：冻融循环通过在解冻时形成冰晶和细胞膨胀来起作用，最终导致破裂。用于藻类和软植物材料。缺点是非常耗时。
高温破碎法：高温和压力会破坏细胞壁内的键，也会使蛋白质变性。尽管速度很快，但如果您的应用受到热对电池其余部分的损害影响，您最好找到另一种方法。
酵素：天然存在的酶可用于去除细胞壁，例如在分离原生质体时，根据您使用的生物组织样本，可以使用纤维素酶、几丁质酶、溶菌酶、甘露糖酶、聚糖酶等溶菌酶。

2. 蛋白质的抽提

在蛋白质的抽提过程中，通常选择适当的溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液溶剂的组成成分、pH、离子强度等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂，使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。细胞碎片等不溶物可用离心或过滤的方法除去。

等电点沉淀法：不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
盐析法：盐析是指在蛋白质水溶液中加入中性盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象。盐析是依据蛋白质溶解度不同进行分离的技术。中性盐是强电解质，溶解度又大，在蛋白质溶液中，一方面与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜；另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出。常用的中性盐有硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，但以硫酸铵为最多。盐析得到的蛋白质一般不失活，一定条件下又可重新溶解，因此这种沉淀蛋白质的方法在分离、浓缩，贮存、纯化蛋白质的工作中应用极广。
有机溶剂沉淀法：中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

3. 样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

凝胶过滤层析法：凝胶过滤层析法又称为排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离，大分子物质被排除在外部，流下路程短，先流出来，而小分子物质能进入层析填料的内部，流下时路程较长，因此会后流出来。
离子交换层析：离子交换层析分离根据是蛋白质的等电点不同，当蛋白质处于不同的pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素。
疏水作用层析：疏水层析也称疏水作用下层析，从分离纯化机制来看，也属于吸附层析一类。疏水层析是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。
亲和层析：亲和层析是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离分子的色谱方法。亲和层析在凝胶过滤色谱柱上链接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和层析可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。