EVIDENT共聚焦/超分辨助力Nature发文揭示应激颗粒亚型鉴定范式

EVIDENT共聚焦/超分辨助力Nature发文揭示应激颗粒亚型鉴定范式

应激颗粒（SGs）是真核细胞在应对各种应激时形成的无膜RNA颗粒，其形成与多种疾病的发生发展密切相关。最近，四川大学生物治疗全国重点实验室贾大课题组在Nature Communications杂志上发表了一项重要研究，揭示了TRIM25在抗病毒SG中的关键作用，为研究应激特异性SG亚型的组成、动态和功能建立了新的研究范式。

应激颗粒（SGs）是真核细胞在应对缺氧、热休克、病毒感染和氧化应激等各种应激时形成的无膜RNA颗粒1。SGs的形成会导致细胞新陈代谢的重新规划、翻译的抑制以及正常细胞信号的改变，从而帮助细胞存活。SG是通过一种称为液-液相分离（LLPS）的物理过程形成的，其中包含许多蛋白质，包括小核糖体亚基、翻译起始因子、翻译受阻的mRNA和RNA结合蛋白2。最近发现了一个由36个SG蛋白组成的核心SG网络，其中G3BP1/2是中心节点3。这些蛋白对调节SG的组装和功能至关重要。在许多病理情况下，如病毒感染4-8、神经退行性疾病9-11和癌症12、13等，SG的组装和分解失调都会发生，这突出了SG在人类疾病中的重要性。最近的研究发现，不同类型的应激会诱导不同的SG亚型，这些亚型在组成、组装和解体的动态以及细胞功能方面各不相同14。例如，亚砷酸钠或热休克处理会诱导形成典型的SG，这种SG更具有活力，能起到促进生存的作用15。与此相反，亚硒酸钠等化疗药物或紫外线照射会导致非典型SG的形成，这种SG的动态性较弱，对细胞有促进凋亡的作用15、16。尽管应激特异性SG亚型的概念正在形成7、15、17-19，但它们不同的蛋白质和RNA组成及功能在很大程度上仍未得到探索。

2024年5月15日，四川大学生物治疗全国重点实验室贾大课题组与合作者在Nature communications杂志( IF=16.6 (2023) / JCR分区: Q1 )在线发表了题为“TRIM25 predominately associates with anti-viral stress granules“ 的研究论文。该工作利用G3BP1邻近蛋白生物素化标记实验发现TRIM25是抗病毒SG的有效标记物。课题组成员发现TRIM25会独立发生LLPS现象，而dsRNA的存在会显著增强这种反应。Poly(I:C)处理和RNA病毒感染都会引发TRIM25和G3BP1的共相分离，从而显著提高TRIM25对底物的泛素化活性，其中许多底物都定位于SGs中。TRIM25和G3BP1的共相分离对激活RIG-I信号通路和限制RNA病毒感染至关重要。该研究不仅为抗病毒信号通路的调控提供了新的见解，而且为研究应激特异性SG亚型的组成、动态和功能建立了一个研究范式。

该研究首先采用了一种邻近生物素化标记（BioID）方法（图1）来鉴定poly(I:C)刺激下的G3BP1相互作用网络。在937个差异蛋白中，有181个属于以前鉴定的SG蛋白成分，包括许多SG核心蛋白，如HDAC6和DDX3X。有趣的是，TRIM25在所有蛋白中增加最为显著，它是一个泛素化依赖性抗病毒先天免疫反应的驱动蛋白，经poly(I:C)处理后富集了130倍（图1）。这意味着，poly(I:C)处理会刺激TRIM25被招募到SG（即抗病毒SG）中。

图1. G3BP1的邻近蛋白标记组鉴定到TRIM25是受poly(I:C)处理富集的SG核心蛋白

(A) G3BP1 BioID方法与基于TMT的定量蛋白质组学相结合的示意图。(B) 如(A)中所确定的，由poly(I:C)处理诱导的SGs核心蛋白列表。

随后，研究人员为了探究poly(I:C)处理导致的TRIM25被招募到SG中是否有特异性，使用各种应激诱导剂，系统地处理了过表达GFP-TRIM25的HeLa细胞：RNA病毒入侵（仙台病毒，SeV）、外源dsRNA应激（poly(I:C)）、氧化应激（亚砷酸钠）、ER应激（毒胡萝卜素）、翻译抑制（嘌呤霉素）、蛋白酶体抑制（MG132）、能量耗竭（CCCP）、热休克和渗透压应激（山梨醇）。并使用四川大学华西第二医院技术平台EVIDENT FV3000激光共聚焦显微镜检测TRIM25与G3BP1颗粒的共定位状态。不出所料地，所有诱导剂都轻易地诱导G3BP1阳性颗粒的形成。有趣的是，虽然在多种条件下都能观察到TRIM25点状聚集，但只有当细胞感染SeV或用poly(I:C)处理时，TRIM25和G3BP1才会形成共定位的点状物（图2）。

图2. TRIM25仅在poly(I:C)和SeV处理下与G3BP1共定位

(A) 具有代表性的荧光显微镜图像显示了在各种应激条件下TRIM25与HeLa细胞中内源性G3BP1的共定位。(B) TRIM25和G3BP1病灶之间的最短距离。在HeLa细胞中，各种应激类型如（A）所示。在所有应激类型中，Sev感染和poly(I:C)处理导致的距离最短。

然后，为了确定TRIM25-G3BP1相互作用是如何促成其共相分离发生的，研究人员构建了一系列TRIM25截短突变体，并将“PTFG”鉴定为TRIM25结合G3BP1所需的最小氨基酸片段（数据未展示）。将mCh-TRIM25（WT或∆PTFG）和GFP-G3BP1共转染到HeLa细胞中，并使用四川大学生物治疗全国重点实验室平台EVIDENT SpinSR转盘共聚焦快速成像和快速超高分辨率系统进行活细胞成像，观察TRIM25液滴和SGs的动态特征。TRIM25 WT和G3BP1液滴在poly(I:C)转染后不到5小时就出现了，并显示出很强的共定位（图3）。相比之下，TRIM25 ∆PTFG液滴的形成明显延迟，直到poly(I:C)处理后8小时才被观察到（图3）。TRIM25 ∆PTFG与G3BP1之间的共相分离倾向远低于TRIM25 WT与G3BP1（图3）。免疫荧光实验进一步证实了这些观察结果（图3）。

图3. PTFG序列是TRIM25与G3BP1形成共相分离所必需的

(A) 转染poly(I:C)后G3BP1（绿色）和TRIM25 WT或∆PTFG（红色）点状颗粒形成的延时显微照片，以及转染后6小时或10小时斑点的放大图像。比例尺：10 µm。插图：白色框内区域的放大图。(B) TRIM25的PTFG基序是与HeLa细胞中的G3BP1共定位所必需的。细胞转染了GFP-TRIM25 ∆PTFG而不是TRIM25 WT。比例尺：10 μm。

最后，研究人员发现TRIM25和G3BP1的共相分离对调节RIG-I信号通路至关重要。使用定量RT-PCR (qPCR)方法测定干扰素通路中多个关键基因的RNA水平。研究人员发现经poly(I:C)处理后，TRIM25 WT能显著增强IFNα、IFNβ、IFNγ和ISG56的表达。相反，转染TRIM25 PTFGAAAA或∆PTFG后，这些IRF3依赖性基因的表达则不被增强（图4）。

图4. TRIM25-G3BP1共相分离激活RIG-I介导的先天免疫

(A-D) 用TRIM25 WT、TRIM25 PTFGAAAA或∆PTFG转染HEK293T细胞，然后用poly(I:C)处理12小时。用qPCR测定IFNα (A)、IFNβ (B)、IFNγ (C)和ISG56 (D)的mRNA水平。

综上，本文作者通过邻近标记G3BP1蛋白互作组结合活细胞成像与无膜细胞器的亚细胞定位分析的方法将TRIM25鉴定为应激颗粒中承担抗病毒功能的重要成分。该工作构建了一个研究应激颗粒亚型的研究框架，有助于开发更有针对性的疗法来治疗与应激有关的疾病。

本文中多色荧光标记的细胞图像都是采用Evident激光扫描共聚焦FV3000拍摄。FV3000的全真光谱技术可以自由调整标记荧光信号的收集波段，并有效防止不同标记之间的荧光串扰，帮助用户获取更加真实可靠的数据。另外，本文还利用FV3000观察了活细胞中的G3BP1液滴以及通过FRAP实验验证了其相分离特性。FV3000灵活高效的龙卷风光刺激模式以及追踪运动中的液滴并分析其漂白区域荧光强度变化的功能，是帮助用户进行相分离研究的利器。（Evident新一代激光扫描共聚焦系统FV4000现已发布。）

Evident新一代激光扫描共聚焦显微镜FV4000

文章中的活细胞实验采用了Evident转盘共聚焦超分辨系统SpinSR，其高速、高分辨率和低光毒性的特点，适合对快速动态变化的活细胞进行长时程观察。

Evident转盘共聚焦超分辨系统SpinSR

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