RNA纯度升级：柱式法提取+DNase联用，数据可靠性提升

RNA纯度升级：柱式法提取+DNase联用，数据可靠性提升

在分子生物学研究与临床检验中，RNA样品的纯度是关系实验成功与否的关键因素。但是，在提取过程中不可避免的DNA污染已经成为影响下游实验的“隐形杀手”。传统的柱式法仅依靠物理截留杂质难以对RNA进行彻底提纯；DNA污染的存在，在qPCR实验中会引起目标基因的假阳性扩增；在转录组学研究中引入非目标基因序列导致测序数据的偏差；在临床诊断中DNA的残留有可能引起误诊的风险。随着单细胞测序、液态活检等精准化技术的普及以及大规模临床样本的检测等大通量场景的出现对RNA纯度、完整性以及标准化的要求日益苛刻。

提取分离原理

1. 充分裂解细胞释放核酸

细胞裂解的彻底性与RNA分子的有效释放，是保证柱式提取RNA提取效率与纯度的决定性环节，直接影响后续实验的准确性与可靠性。

以胍盐裂解液为例，简述其作用原理：首先胍盐或GITC能够快速地破坏细胞膜，且胍盐是蛋白强变性剂，可以促进核蛋白体的解离，同时高浓度的胍盐是核酸酶的强抑制剂，可以使细胞核内的核酸酶失活，从而提高RNA的提取效率。

2. 硅胶柱膜对RNA的特异性吸附

硅胶柱对RNA的特异性吸附主要涉及以下三个部分：

• 氢键的形成
• 疏水作用
• 选择性差异

RNA的磷酸骨架在高浓度盐离子和低pH的环境中带负电荷，而硅胶膜部分质子化（Si-OH2+），削弱RNA分子间的静电排斥，使RNA的构象趋于舒展，促进两者间氢键的形成。且在正常条件下，RNA分子表面被一层亲水膜覆盖，但在高盐液（如盐酸胍、异硫氰酸胍）环境下，RNA的水层被破坏，疏水区域暴露，并与硅胶膜相互作用进一步增强吸附性。硅胶柱膜的孔径大小与结构特征恰好能够吸附RNA。

3. 对RNA的洗涤与洗脱

洗涤：高盐条件下，蛋白质会失去天然构象，形成不溶性沉淀；多糖由于空间位阻效应与硅胶膜的亲和性较低；而DNA为刚性的双链结构，对硅胶膜的亲和力较低。且洗涤液通常含有乙醇和异丙醇可以进一步促进残留疏水溶质的溶解和洗脱。

洗脱的本质是利用洗脱缓冲液破坏硅胶柱膜与RNA分子之间的相互作用力，主要的作用可总结为以下两点：

• 氢键的破坏
• 疏水作用的减弱

洗脱液通常为无核酸酶水或低盐缓冲液，会降低硅胶模表面的质子化程度，破坏RNA与膜表面的静电作用与疏水作用。

操作步骤详解

1. 样品准备

• 组织样品：将新鲜或经液氮速冻处理的组织匀浆处理，再加入裂解缓冲液充分混匀（约每15-20mg加入600μl裂解液），室温放置3-5min，使核酸蛋白复合物完全分离，14000r 离心2min，收集上清液加入等体积裂解液，轻轻颠倒混匀3-5次。

• 细胞样品：将细胞用胰酶消化下来，制备细胞悬液，离心弃上清液，每10^6个细胞加入600μl裂解缓冲液充分混匀，使固悬物溶解、溶液澄清 ，转移上清液加入等体积裂解液，轻轻颠倒混匀3-5次。

2. 提取RNA

将混合物（以及沉淀）转移至纯化柱内，12000r 30s 离心，弃废液。加入洗涤液，12000r 30s 离心。

3. DNase I处理

将离心柱置于新的无RNase离心管中。配制DNase反应液：将DNase I与DNase反应缓冲液混合。将DNase反应液直接加到柱膜中央，室温孵育15-30分钟。孵育后，加入洗涤缓冲液，离心12000r 1min离心，弃去滤液。

4. 洗脱RNA

将离心柱转移到新的无RNase离心管中。向柱膜中央加入30-50 μL洗脱缓冲液（无RNase水或低盐缓冲液）。静置1-2min，后离心12000r 1min洗脱RNA。

避坑指南

1. 样本选择与处理

• 选取合适样本：优先选择目标RNA含量高、杂质少的样本。例如在研究动物基因表达时，肝脏、肾脏等代谢活跃的组织通常RNA含量丰富且杂质相对较少；对于植物样本，嫩叶、幼芽等部位的RNA质量较高。

• 彻底去除杂质：对于植物样本，要去除表面的泥土、灰尘等杂质，可先用清水冲洗，再用无菌水漂洗；对于动物组织，要剔除脂肪、结缔组织等，如在提取小鼠肝脏RNA时，需小心去除周围的脂肪组织。

• 防止样本降解：样本采集后应立即进行处理，若不能及时提取RNA，需采用适当的保存方法。如血液样本可加入RNA保护剂，组织样本可液氮速冻后保存于-80℃冰箱，避免反复冻融以及因样本放置时间过长或保存条件不当导致RNA降解，影响纯度。

2. 裂解步骤

• 充分裂解：确保样品完全裂解，对于组织样品。可以使用匀浆器或超声波破碎仪帮助裂解。对于植物样品，可以延长裂解时间、提高裂解温度以及采用含多糖去除剂的裂解液。样品离心裂解后如果出现胶状物，应与上清液一同转移到下一步骤。

• 裂解液比例：比例应该适当（按照试剂盒提供的具体比例与方法），用量过多或者过少均会对RNA的质量造成影响。

• 防止样品降解：提取RNA时，样本全程置于冰上。

3. 洗涤与洗脱

• 使用合适洗涤液：按照试剂盒说明配制洗涤液，确保洗涤液中的乙醇浓度准确。通常使用70%-80%的乙醇溶液进行洗涤，可有效去除盐离子和其他杂质。

• 可增加洗涤次数：对于杂质含量较高的样本应增加洗涤次数，且确保每次洗涤后确保无洗液残留。

• 控制洗脱条件：洗脱液可进行预热到60℃-70℃，可提高洗脱效率。洗脱液应加到柱子中心，且避免接触到膜。

4. 其他注意事项

• 防止RNase污染：选择无RNase的耗材和试剂。操作时戴手套，避免外源RNase污染。

• DNase处理：DNase孵育时间不宜过长，以免影响RNA质量。用DNase I进行处理时应加入缓冲液，保证DNase I的作用活性。

• 调整结合条件：严格按照试剂盒说明书要求，控制结合缓冲液的用量和pH值。一般来说，pH值在7-8之间有利于RNA与硅胶柱的结合。