【资源】糖化血红蛋白及检测方法学对比
【资源】糖化血红蛋白及检测方法学对比
糖化血红蛋白（HbA1c）是糖尿病诊断和监测的重要指标。本文详细介绍了HbA1c的定义、检测方法、标准化进程及其在临床上的应用，帮助读者全面了解这一重要指标的相关知识。
糖尿病与HbA1c
糖尿病是一种历史悠久的疾病，早在公元前1500年就有相关记载。随着医学技术的发展，糖尿病的诊断测试也经历了重大变革。在过去四十年中，重点已从血糖水平和口服葡萄糖耐量试验转向HbA1c水平的测量。随着检测糖化血红蛋白百分比的现代化和标准化方法的出现，临床医生越来越依赖HbA1c来管理糖尿病患者。
全球糖尿病及其并发症的负担正在迅速增加，据估计，到2045年将有6.286亿人患有糖尿病。大约有一半的糖尿病患者并不知道自己患病。因此，需要一个低成本、可靠且健壮的工具来诊断和监测疾病进展。HbA1c长期以来被认为是糖尿病的监测工具，近年来也被认为是2型糖尿病（T2DM）的诊断工具。
2011年，世界卫生组织（WHO）提倡使用HbA1c诊断糖尿病，其值为48mmol/mol（6.5%）。WHO指南明确指出，只有在有严格的质量保证测试，并且化验按照与国际参考值一致的标准进行标准化的情况下，才能使用HbA1c进行诊断。因此，用于糖尿病诊断的HbA1c方法制造商必须能够证明其符合国际临床化学和实验室医学联合会（IFCC）的参考测量程序，并在质量保证计划中表现出良好的准确性。
什么是糖化血红蛋白？
糖化血红蛋白是在葡萄糖与血红蛋白分子β链的N-末端缬氨酸结合时形成的。这个糖基化过程是非酶促的，因此只依赖于时间、葡萄糖浓度和血红蛋白水平。一般认为红细胞循环时间约为120天，变化率为20%，因此，HbA1c代表了血红蛋白在大约120天内接触的平均葡萄糖浓度。这种长时间的葡萄糖暴露整合使得HbA1c成为一个有价值的标记物，其评估血糖控制的时间跨度远超过单次血糖检测。
糖化血红蛋白测试不需要禁食，其水平也不会受到压力、运动和吸烟的严重影响。这些因素使得HbA1c成为诊断和监测糖尿病的良好方法。人血中糖化血红蛋白的测定对糖尿病患者血糖状态的长期控制至关重要。
为什么临床上提到糖化血红蛋白用的是HbA1c？
在早期研究长期血糖控制指标的文献中，曾出现过多种糖化血红蛋白的亚型，但HbA1c因其在血糖检测中的重要地位，以及在人血中所占比例最多（70%〜90%）且占比稳定而备受关注。这让HbA1c比起其他亚型更受关注，已陆续被各大糖尿病疾病预防和控制组织视为血糖控制的金标准。
例如，美国糖尿病学会（ADA）将HbA1c作为诊断糖尿病的标准之一，写入学会的糖尿病诊疗指南；国际糖尿病联盟（IDF）的新版亚太糖尿病防治指南中，明确规定HbA1c是国际公认的糖尿病监控金标准。ADA建议的HbA1c理想控制水平为≤7%，IDF建议的HbA1c理想控制水平为≤6.5%，我国临床血糖控制中常用的参考水平为6.5%以下。我国卫生部临床检验中心（NCCL）室间质评自2000年加入HbA1c分组以来，平均室间CV已逐渐缩小至4.6%，评价标准靶值的总误差约为±8%。
《中国血糖监测临床应用指南》指出，“尽管6.5%被ADA和WHO推荐为糖尿病诊断的切入点，由于HbA1c检测缺乏广泛应用、缺乏标准化、检测性能不能满足临床要求等原因，目前在国内尚不推荐使用”。
糖化血红蛋白测定方法原理
目前市场上有100多种HbA1c检测方法，它们都基于两个原则之一：基于电荷差异的分离和基于结构差异的分离，这两个原则都是在葡萄糖与Hb结合时发生的。前一种原理用于离子交换色谱和电泳分析法，而后一种原理用于免疫分析、基于硼酸亲和层析的分析和酶法。
基于电荷差异的方法
基于电荷差异的方法依赖于当葡萄糖附着在HbA b链的N-末端缬氨酸上时所产生的额外负电荷。例如阳离子交换色谱法和电泳法。阳离子交换色谱法是一种根据混合物中分子的电荷特性分离蛋白质混合物的方法。带电Hb和其他Hb组分在不同的时间洗脱，取决于分子的净电荷与通过阳离子交换柱的离子强度缓冲液梯度的关系。毛细管电泳（CE）利用自由溶液中的液相流动原理。利用该技术，带电分子在特定pH值的碱性缓冲液中通过电泳迁移率分离。不同Hb组分的分离在石英毛细管中进行，迁移在高压（例如9800伏）下进行，并使用Peltier装置进行温度控制。使用光学检测器在毛细管阴极端414nm的吸收波长处检测Hb。
基于结构差异的方法
亲和力分离是基于糖化血红蛋白中葡萄糖顺式二醇与硼酸盐基质的共价结合。非糖化血红蛋白不与硼酸盐基质结合，直接从柱中洗脱。HbA1c最初与柱结合，并在应用对硼结合位点具有更高亲和力的缓冲液时释放，从而置换结合的HbA1c。所得色谱图显示两个峰，一个非糖基化峰和一个糖基化峰。免疫分析利用特异性抗HbA1c抗体识别前三、四或五种氨基酸和附着在Hb分子β-链N端的葡萄糖。用双色法分别测定总血红蛋白，并计算两组分的比值。分析设计有很大的不同，从免疫比浊法到乳胶凝集抑制法（使用单克隆抗体）。酶法原理包括两个单独的步骤：通过酶解获得的糖化二肽的测量和总血红蛋白的测量。通过添加果糖基测定糖化二肽氧化酶产生过氧化氢，在过氧化物酶存在下与有色物质反应。吸收能力的变化是通过局部计算HbA1c浓度来测量的。血红蛋白转化为稳定的甲基苯丙胺，通过吸光度测定血红蛋白浓度。然后计算两组分（糖化二肽和总血红蛋白）的比值。
不同方法原理的优缺点及性能
不同的方法原理各有优缺点，方法的选择将取决于临床和分析因素。
离子交换法与良好的性能相关，但通常容易受到Hb变体的干扰，这可能会产生错误的低或高HbA1c结果。为了识别Hb变异的干扰，需要检查每个色谱图是否有异常峰；手动或通过计算机编程，这需要对运行仪器的医疗专业人员进行额外培训。然而，一些罕见的变异体可能显示正常的色谱图，其中Hb变异体隐藏在A0峰下，从而产生错误的低HbA1c结果。亲和层析的一个优点是不受Hb变异体或类似氨甲酰化Hb的衍生物的干扰，这导致该方法通常被用作Hb变异体患者的选择方法。然而，由于HbF不具有b链，这导致Hb分子糖基化程度极低，表明HbF的干扰大于20%。
当前免疫分析方法的一个优点是，这些全自动系统可以实现高通量，可以集成到实验室跟踪系统和样品管理设施中。另一个优点是，大多数免疫分析不受常见Hb变体（如HbAS, HbAC, HbAD, 和HbAE）的干扰。只有一些罕见的血红蛋白变异（前三个、四个或五个氨基酸被另一个氨基酸取代）已知会引起干扰。CE对市场来说相对较新，可以同时测量多个样本，但可能具有有限的吞吐量。酶法目前需要一个大型的主实验室分析仪，因此它们不适合小型实验室或糖尿病诊所使用，但可以促进高通量。
近年来，不同方法原理的性能有了显著的提高。HbA1c测量的国际质量标准有助于质量评估。全球绩效标准最近由IFCC实施HbA1c标准化工作组制定，并基于sigma指标的使用。这些目标已由工作队确定，并使用了总允许误差（TAE）的概念，该概念将偏差和不精确性的影响合并为一个单一的衡量标准。标准规定，在50mmol/mol（6.7%）水平下，HbA1c的总误差不超过5mmol/mol（0.46%）。西格玛水平用于定义预期目标超出目标范围的频率。例如，在2r水平下，20分之一的结果预计会超出目标范围，这被认为是可以接受的。表0：见附件
糖化血红蛋白标准化的历史
在DCCT和UKPDS试验开始时，没有参考资料，因此，实验室间变异系数（CV）很高（>20%）。不同方法和报告结果的多种方法（如总糖基化，HbA1和HbA1c）使医生很难在临床实践或大规模研究中比较结果。表1详述了糖化血红蛋白标准化历史上的关键时间点。DCCT和UKPDS研究使用了相同的HbA1c测量系统，并对两项研究中的样本进行了密切监测，从而使结果趋于一致。DCCT最初使用Bio-Rex 70离子交换法，在评估后转换为Bio-Rad Diamat高效液相色谱法（高效液相色谱法），以协调两种方法的结果，因为它提供了更大的自动化和更高的吞吐量。尽管这项研究是使用Bio-Rad Diamat完成的，但两种方法之间的随机盲法研究样本的比较仍在继续，以验证整个研究剩余时间内的持续关系。
如表1总结。
IFCC标准
1994年，IFCC成立了一个HbA1c标准化工作组，负责制定HbA1c标准，包括几乎纯的HbA1c和HbA0，以及HbA1c的主要参考方法正在进行中，AACC和ADA接受通过NGSP进行协调，作为过渡解决方案，直到实现真正的标准化。IFCC糖化血红蛋白标准化工作组成功地制备了标准物质并定义了参考测量程序，该程序于2002年发表（下图）。此外，还建立了一个实验室网络，其中包括两种参考方法，即质谱（MS）和CE。目前，全世界有21个实验室使用高效液相色谱-毛细管电泳法或高效液相色谱-质谱法运行IFCC-PRM。每个网络实验室使用纯化的糖化血红蛋白和糖化血红蛋白的混合物作为校准品。糖化血红蛋白参考实验室IFCC网络的主要任务是为次级参考物质赋值，并与诊断设备制造商和EQAS组织者合作，以确保方法可追溯到IFCC参考测量程序（PRMP）。图3显示了糖化血红蛋白IFCC标准化的可追溯性链。该过程在患者结果和主要参考材料之间提供了一个完整的链，从而确保患者获得正确的结果，这可以与临床目标和大规模研究数据进行普遍比较。
图1：HbA1c和HbA0分离思路
图2：IFCC参考方法
影响HbA1c检测的因素
尽管严格按照标准程序进行检测，也有一些因素影响HbA1c的结果
图3：国际临床医学联合会流程图化学和检验医学参考测量HbA1c检查程序。
影响因素总结在下表3
我国现状
表4：2017年在我国一些实验室关于糖化血红蛋白使用的原理、仪器、试剂和校准器
绝大多数被试（88，65.2%）（共135个实验室）被评为“需要改进（Ò<3）”，表明实验室需要改进其测量性能。只有8.2%（11/135）的实验室被评为“世界级”实验室。88个实验室的Ò值分别低于3、52（59.1%）和23（26.1%）需要提高测量精度（QGI<8.0）和真实度（QGI>1.2）；其余实验室（13、14.8%）需要提高测量精度和真实度。此外，“TOSOH”组和“ARKRAY”组的实验室分别有16.1%（5/31）和15.0%（3/20）被评为“世界级”，而“BIO-RAD”组的实验室均未被评为“世界级”。
也就是说，虽然参加的实验室是国内性能较好的实验室，但仍不尽如人意，半数以上的实验室被评为“需要改进（Ò<3）”。在我国将糖化血红蛋白检测纳入糖尿病诊断之前，应采取措施提高糖化血红蛋白检测的绩效。Òmetric是一种有用的工具，可用于评估测量性能，并有助于识别改进分析的方向（真实性、精密度或两者兼而有之）。建议实验室积极参与EQA项目，制定适当的绩效目标，并努力实现这些目标。
本文原文来自丁香园（DXY）