一文搞懂二代测序，illumina，桥式PCR，边合成边测序（参照官方视频）

一文搞懂二代测序，illumina，桥式PCR，边合成边测序（参照官方视频）

引用

CSDN

1.

https://blog.csdn.net/qq_57589581/article/details/144977229

illumina二代测序技术是现代生物信息学的重要组成部分，广泛应用于基因组学、转录组学等领域的研究。本文将详细介绍illumina二代测序的四个主要步骤：样本准备、簇生成、测序和数据分析。

简述

illumina二代测序分为4步：

1. sample prep  样本准备
2. cluster generation  簇生成
3. sequencing  测序
4. data analysis  数据分析

1. sample prep 样本准备

样本准备，即文库构建。用超声波分割DNA片段（灰色），两端用酶先补平。在3'端加上A碱基，再用酶把两端特定接头（adapter，彩色部分）加上去。

1.1 adapter成分

接头adapter：

1. 橙色：测序结合位点
2. 紫色：寡聚核苷酸引物的互补序列

2. cluster generation 簇生成

用于扩增DNA片段。更多的DNA片段可以增强信号，避免测量时，由于返回信号过于相似导致的错误。

2.1 flow cell流动池

由大到小分别为： Lane>Swath>Tile
一个大甬道Lane分割为n个平行的小甬道Swath，每个小甬道上由一个个小格子Tile。
每个大甬道的两端分别有一个小孔，即液流孔，分别用于引导溶液的进入和排出（单向）。

2.2 扩增流程

lane（大甬道）内表面如图，预置了两种不同寡居核苷酸引物，每个小球代表一个碱基。
每种引物通过共价键连接至flowcell表面，并且这两种引物分别与拼接在DNA片段上的核苷酸序列互补。
一般每次6-8位

重点
-为什么用共价键？
共价键保证连接的强度，避免在液体流动过程中被溶液冲走
-为什么要互补？
互补意味着，在扩增过程中，可以用将DNA片段可逆的固定在板子上。用碱性溶液可以轻松解开配对。

2.3 桥式PCR扩增详细流程

1. 在引物匹配的板子上，加入处理过的DNA片段，即DNA文库（内含少量DNA片段）。
2. 加入dntp和DNA聚合酶（紫），复制DNA，形成互补链（图中紫色处为杂交匹配）
3. 加入NaOH，洗去未固定链，生成固定（共价键，磷酸二酯）在flowcell上的单链
4. 加入中性溶液，链的另一端（蓝）就会和板子上的另一种引物匹配，折叠为桥形。
5. 加入匹配蓝色引物的dntp和DNA聚合酶，由蓝–>紫方向复制DNA（区别于2）。此时紫->蓝方向为互补序列，蓝->紫方向恰好为原序列。
6. 加入NaOH，解开双链。与初始状态相比，已经扩增了2^1倍。
7. 加入中性溶液，此时链尾会和板子上匹配的引物杂交，形成新的桥。
8. 
   多次重复5-7，直至flowcell上全部引物都有桥连接。
9. 加入NaOH，全部变为单链。
   10.加入特定酶，切除紫色引物特定酶，使之不再能发挥匹配作用。 扩增完成。

3. sequencing 测序

从远板端–>近板端看，此时flowcell上已经拥有大量的，与原链同序的DNA片段。

3.1 边合成边测序详细流程

测序原理是不断按位添加碱基，每添加一次，就检测一次荧光强度，最终实现按位读取出全部序列。

1. 中性溶液加入测序引物（紫），用于结合远板端
2. 加入带有不同颜色荧光标记的碱基，聚合酶等，用于每次只增加一个碱基。（核心技术：荧光修饰可逆合成终止。每请参考下图结构式，箭头处增新修饰了一个叠氮基团，可以实现按位结合）。
3. 激光扫描一次，得到一位荧光信号。
4. 解析荧光信号，推理荧光信号互补的字母。
5. 添加化学试剂，特异性切除叠氮基团和荧光标记，并洗去。此时flowcell上状态为不发光，可结合。
6. 重复2-5，直至全部完成。这是一个大规模并行的过程，一次可数以千万计的簇
   。在图中每个光点就是一个簇，即为一个小格子（Tile）。
7. 在每一次走完上述流程后，要进行index的读取。先将该次读段产物用碱洗掉再加入index1的测序引物，一般位于蓝色引物的前几位。（index=barcode：接头设计之初内置了一个特定标记，作为该DNA片段的编号）

3.2 双端测序详细流程

上一小节“边合成边测序，每次有效位数为6-8位。该方法PCR扩增时用桥式，而在按位测序时，链尾是自由的，非桥式。
而illumina的另一个核心技术是，在扩增及检测时都使用桥式，有效长度增加了一倍。每次检测在正反两端分别检测一次，大大提升了效率。
链首链尾分别用不同的index1，index2加以区分。

1. 在完整进行边合成边测序（上一小节）后，洗去原链，保留反向链
2. 加入蓝引物，重复边合成边测序，得到互补序列。（由蓝->紫）
3. 数据分析，看是否反向互补

4. data analysis数据分析

上述过程大量并行，以引物唯一序列index作为唯一标记，已经生成了数百万甚至数千万个序列。

4.1 片段拼接流程

1. 在这些序列中，一定存在index1和index2（这是随机的两个index）所引领的序列完全互补，用计算机进行匹配。
2. 在完全互补后，找出部分互补序列。在两序列大部分互补，只有少部分反向延申时，认为他们出自统一DNA片段。，将他们拼接起来。
3. 引入参考基因组，进行目标DNA的突变识别等工作。