强致腐性猪肉源莓实假单胞菌的分离与大蒜精油对其抑菌机制
强致腐性猪肉源莓实假单胞菌的分离与大蒜精油对其抑菌机制
随着我国人民生活水平的提高及冷链运输系统的不断完善，冷鲜肉逐渐成为肉类消费主流。食源性微生物对肉类的污染不仅会使肉制品的货架期缩短、感官品质下降，还会对消费者的身体健康造成严重威胁。已有大量研究表明，假单胞菌属（Pseudomonas spp.）、不动杆菌属、肠杆菌属、热杀索丝菌和乳酸菌是引起冷却猪肉腐败变质的主要菌群。 植物精油通常从香辛料和中草药中提取，是一种天然防腐剂，能够有效抑制微生物生长、延长货架期。大蒜精油是大蒜中一种呈明亮琥珀色的天然液体提取物，前期研究显示大蒜精油具有较好的抑菌效果。
山东农业大学食品科学与工程学院的欧凯玉、张一敏、毛衍伟*等 通过分离有氧贮藏条件下冷鲜猪肉中的莓实假单胞菌并测试其致腐能力，选择致腐能力强的莓实假单胞菌作为实验菌株，探究大蒜精油对其抑制能力和作用机制。
强致腐性猪肉源莓实假单胞菌的分离纯化、鉴定及筛选结果
猪肉源假单胞菌的分离与纯化结果
在4 ℃有氧贮藏条件下贮藏末期（12 d）的冷鲜猪肉中，通过CFC选择性培养基分离出18 株假单胞菌，通过氧化酶试纸片验证后用于后续实验。
猪肉源假单胞菌的菌落特征和菌体形态特征
对分离出的18 株假单胞菌进行培养，观察其菌落及形态特征，结果见表1。
猪肉源假单胞菌分子生物学鉴定结果及系统发育树的构建
将分离出的18 株猪肉源假单胞菌以总DNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果登录NCBI网站进行BLAST序列对比，并构建系统发育树。由图1可知，C-A2-1、C-B1-2、C-B2-1、C-C1-2与莓实假单胞菌16S rDNA的同源性达99%以上，结合菌落特征和形态特征观察，可判定C-A2-1、C-B1-2、C-B2-1、C-C1-2为莓实假单胞菌。
优势莓实假单胞菌的筛选
冷却猪肉腐败过程中菌落总数的动态变化
微生物生长繁殖是引起肉样腐败变质的主要原因，因此菌落总数是衡量肉样腐败的重要指标。由表2可知，接种野生莓实假单胞菌的处理组和空白对照组的菌落总数随着贮藏时间的延长均呈上升趋势，且处理组菌落总数的增长速率明显高于空白对照组。这说明莓实假单胞菌能在4 ℃低温贮藏环境下利用肉中营养物质进行快速生长繁殖，导致肉品腐败。
冷却猪肉腐败过程中TVB-N含量的动态变化
TVB-N含量是评价肉品新鲜程度最重要的指标，GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》规定，生鲜肉类TVB-N含量不可超过15 mg/100 g。由表3可知，随着贮藏时间的延长，接种莓实假单胞菌处理组TVB-N含量的增长速率高于空白对照组，且贮藏末期各莓实假单胞菌处理组的TVB-N含量均显著高于空白对照组（P＜0.05）。这说明莓实假单胞菌能在4 ℃低温贮藏环境下导致肉品腐败，使肉中蛋白质分解产生氨及胺类等碱性含氮物质。
优势腐败菌致腐能力的定量分析结果
研究表明，腐败代谢产物的产量因子可以作为评价肉类腐败菌致腐能力的定量指标，腐败代谢产物的产量因子越高，肉类腐败菌致腐能力越强。由表4可知，A2-1菌株Y（TVB-N/CFU）最高，故选其作为实验菌株。
大蒜精油抑菌成分测定结果
大蒜精油GC-MS分析总离子流色谱图如图2所示。
在谱库中共检出27 种化合物（表5），其中含量最高的为二烯丙基二硫醚，约占总化合物含量的51.65%；其次是二烯丙基三硫醚，约占总含量的13.71%，二者是大蒜精油主要活性成分大蒜素中的主要组分。有研究证实，大蒜的抗氧化、抑菌等生物活性及其药用功能主要源自其较高的有机硫化物含量。
大蒜精油对强致腐性猪肉源莓实假单胞菌的抑制效果
大蒜精油对莓实假单胞菌的MIC
由表6可知，大蒜精油对莓实假单胞菌具有较好的抑菌效果，且抑菌能力随其体积浓度的增加而增加。当大蒜精油体积浓度为0.0625 μL/mL时，肉汤培养基出现明显浑浊；当大蒜精油体积浓度为0.125 μL/mL时，肉汤培养基仍呈澄清状态，即大蒜精油对莓实假单胞菌的MIC为0.125 μL/mL。
莓实假单胞菌生长曲线
在一定波长范围内，菌悬液浓度和光密度成正比，故可以通过特定波长范围的光密度判断大蒜精油对莓实假单胞菌生长的影响。由图3可知，加入等体积无菌水的空白对照组和加入等体积DMSO的阴性对照组OD595 nm随时间延长呈上升趋势，且均呈符合典型细菌生长特点的S型生长曲线，其中阴性对照组微生物的生长速率略低于空白对照组，但24 h时2 组OD595 nm接近，这说明DMSO溶液对莓实假单胞菌的生长影响较小。1 MIC和2 MIC大蒜精油处理组的菌液OD595 nm未出现上升现象，细菌几乎停止生长，表明大蒜精油可以有效抑制莓实假单胞菌生长。
大蒜精油抑菌机制
莓实假单胞菌形态变化
由图4可知，空白对照组中的菌体呈正常短杆状，形状饱满、表面光滑，未出现细胞破裂、内容物流出等现象；DMSO处理4 h后的莓实假单胞菌表面有轻微褶皱，大部分菌体完好，这说明DMSO溶液对莓实假单胞菌的影响甚微。经1 MIC和2 MIC大蒜精油处理4 h后莓实假单胞菌中能观察到菌体出现褶皱，部分细胞碎片散布在菌体周围，同时有少量菌体破裂；且随着大蒜精油浓度增大，菌体褶皱程度上升，破裂菌体数量也相应增加。由此可见，大蒜精油可以破坏莓实假单胞菌的细胞完整性，影响菌体正常生理活动。
大蒜精油对莓实假单胞菌细胞膜通透性的影响
β-半乳糖苷酶是一种内源性水解酶，存在于细胞的细胞质中，胞外β-半乳糖苷酶的存在通常与细胞膜通透性改变及完整性被破坏有关。当细菌细胞内膜受到损伤时，β-半乳糖苷酶会释放到细胞外，与荧光物质反应后产生具有蓝色荧光的甲基伞型酮。该荧光基团的吸收峰出现在365 nm、散射峰出现在460 nm，可作为一种检测信号测定细菌细胞内膜损伤程度。由图5可知，与对照组和阴性对照组相比，1 MIC和2 MIC大蒜精油处理组荧光强度显著增加（P＜0.05），且随着大蒜精油浓度的增加，荧光强度逐渐增大。结果表明，大蒜精油可以有效破坏莓实假单胞菌细胞膜的渗透性，且随着大蒜精油浓度增大，细胞膜的损伤程度也逐渐增加。
大蒜精油对莓实假单胞菌运动性的影响
单一泳动和群体泳动均是依赖细菌鞭毛使细菌能够找到理想位点黏附的运动方式，在细菌生存和定植中起关键作用。单一泳动表现为细菌个体在液体环境中由鞭毛推动的易位行为。由表7可知，相较于空白对照组，添加0.5 MIC、1 MIC、2 MIC大蒜精油的处理组中莓实假单胞菌的单一泳动能力均受到不同程度的抑制；此外，大蒜精油对莓实假单胞菌运动性的抑制程度随着大蒜精油浓度和处理时间的延长呈上升趋势，其中1 MIC、2 MIC大蒜精油处理12 h后对莓实假单胞菌单一泳动能力的抑制率均为100.00%。
群体泳动表现为细菌菌体在黏性环境中由鞭毛推动的群集交互作用。由表8可知，相较于空白对照组，添加0.5 MIC、1 MIC、2 MIC大蒜精油的处理组中莓实假单胞菌的群体泳动能力均受到不同程度的抑制，且抑制程度随着大蒜精油体积浓度增加和处理时间延长呈上升趋势，其中1 MIC大蒜精油处理12 h、2 MIC大蒜精油处理3 h后对莓实假单胞菌群体泳动能力的抑制率为100.00%。
大蒜精油对莓实假单胞菌代谢活力的影响
活细胞在脱氢酶的作用下会生成一种活化氢离子，该离子能将INT还原成甲瓒，因此可以利用甲瓒的生成速率来推测细胞的代谢活力。代谢活力越弱产生的氢离子越少，还原生成的甲瓒越少，菌液OD595 nm越小。由图6可知，随着培养时间的延长，空白对照组和阴性对照组的OD595 nm略有增加，这可能是由细胞生长繁殖导致；1 MIC和2 MIC大蒜精油处理组OD595 nm在0～3 h急剧降低，且均显著低于对照组（P＜0.05），这说明大蒜精油对莓实假单胞菌的代谢有抑制作用；1 MIC和2 MIC大蒜精油处理组OD595nm在3～12 h略有上升但仍显著低于对照组（P＜0.05），这可能是由于小部分存活菌体为抵抗抑菌物质所导致的代谢活力增强。
结论
莓实假单胞菌对猪肉具有较强的致腐能力，是有氧贮藏条件下冷却猪肉中主要的致腐微生物之一；大蒜精油对猪肉源莓实假单胞菌有较好的抑制作用，MIC为0.125 μL/mL；大蒜精油会破坏莓实假单胞菌正常细胞形态，增加细胞膜通透性，从而导致细胞皱缩破裂和胞内物质外泄；大蒜精油抑制莓实假单胞菌的运动性，从而影响正常的生长繁殖；此外，大蒜精油会抑制莓实假单胞菌的代谢，引起菌体代谢活力降低，从而导致胞内代谢紊乱、抑制菌体生长。本研究揭示了大蒜精油抑制猪肉源莓实假单胞菌的机制，为大蒜精油用于猪肉制品保鲜提供了理论支持。目前对于大蒜精油抑菌机制的研究主要集中于菌体结构水平，未来可通过代谢组学、蛋白质组学、转录组学及多组学联合分析方法展开深入研究，进一步探究大蒜精油的抑菌机理。
本文《强致腐性猪肉源莓实假单胞菌的分离与大蒜精油对其抑菌机制》来源于《食品科学》2024年45卷第16期25-32页，作者：欧凯玉，张一敏，梁荣蓉，杨啸吟，毛衍伟*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231027-223。