截短M13噬菌体结合暗场显微镜，30分钟检测大肠杆菌
截短M13噬菌体结合暗场显微镜，30分钟检测大肠杆菌
大肠杆菌（E. coli）是最常见的肠道食源性病原体之一，其监测对食品安全和环境至关重要。开发更高效、快速的方法来检测食品和环境样品中的大肠杆菌菌株至关重要。传统的方法，如培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应（PCR），具有明显的局限性，比如需要较长的处理时间或专用仪器。暗场显微镜以其操作方便、速度快、环境条件不严格等优点在生物分析领域得到了广泛的应用。
截短的M13噬菌体：特异性靶向大肠杆菌
作为大肠杆菌的特异性噬菌体，M13噬菌体的亲和力低至2 pM。M13噬菌体的外壳由pVIII、pIII、pVI、pVII和pIX等关键蛋白组成，它们共同构建和维持噬菌体结构，介导宿主细胞感染。pVIII是主要的外壳蛋白，线性排列在大约2700个分子中，形成噬菌体特有的细长圆柱形结构。pIII负责识别宿主细胞表面的F菌，是感染的关键介质。由于其具有靶向特异性肽、结构稳定性和高度有序的丝状衣壳结构的能力，M13已被选择作为治疗和传感应用的功能性生物材料。
利用成熟的噬菌体展示技术，M13噬菌体经常被用于构建生物探针以靶向捕获特定分子。然而，作为探针材料的生物支架，较短的M13噬菌体可能比较长的菌丝更有利。这是因为野生型M13噬菌体的长度为880纳米，直径只有6纳米，类似于一根高度灵活的绳子，当M13探针用于高浓度的检测目的时，它们往往会缠结。这种缠结会模糊结合位点并导致聚集，最终导致某些探针失去结合能力。由于M13的长度由包装基因组的长度决定，因此对M13噬菌体的环状单链基因组（cssDNA）进行操作可以改变其长度。
暗场显微镜技术：提升检测效率的关键
暗场显微镜技术是一种常用的生物分析工具，通过散射光线形成明亮物体像，用于改善未染色透明样本的对比度。在暗场照明下，只有物体微粒散射的光线束进入物镜，从而在暗视场上形成明亮物体像。这种技术特别适用于观察和分析透明或半透明的生物样本，能够提供比传统明场显微镜更高的对比度和清晰度。
暗场显微镜技术具有以下特点：
- 高对比度：通过散射光形成明亮的物体像，使样本在暗背景下更加清晰可见。
- 无需染色：适用于未染色的透明样本，避免了染色过程可能带来的干扰。
- 操作简便：相比其他高级显微镜技术，暗场显微镜的操作更为简单快捷。
- 环境适应性强：对环境条件要求不高，适合在各种实验室条件下使用。
创新检测平台：结合M13噬菌体与暗场显微镜
近日，来自扬州大学动物医学院的研究者们在J Nanobiotechnology杂志上发表了题为“Truncated M13 phage for smart detection of E. coli under dark field”的文章，本研究利用截断的M13噬菌体作为捕获探针，并结合暗场显微镜，建立了一种快速准确的大肠杆菌检测策略。
研究者采用双质粒策略生成截断的M13噬菌体（tM13），这个工程tM13包含两个关键的遗传修饰：pIII的N端部分突变和pVIII的疏水端生物素化。这些改变使tM13能够有效地附着在不同的大肠杆菌菌株上，促进快速磁分离。为了检测，研究者还实现了一种基于卷积神经网络（CNN）的算法，用于使用暗场显微镜对细菌细胞进行精确鉴定和定量。
从峰值和临床样品分析中获得的结果表明：基于tM13的免疫磁富集方法结合人工智能分析具有准确性、高灵敏度（检测限为10 CFU/μL）和节省时间（30分钟）的特点，从而支持其在复杂样品中促进多种大肠杆菌菌株鉴定的潜力。
应用前景与未来展望
这项新技术在食品安全和疾病防控领域具有广阔的应用前景。与传统检测方法相比，该技术具有以下显著优势：
- 快速检测：仅需30分钟即可完成检测，大大缩短了传统方法所需的数小时甚至数天的时间。
- 高灵敏度：检测限低至10 CFU/μL，能够检测到极低浓度的大肠杆菌。
- 适用性强：适用于各种复杂样品，如食品、水样和临床样本等。
- 智能化分析：结合卷积神经网络算法，提高了检测的准确性和自动化程度。
未来，随着技术的进一步优化和推广，基于截短M13噬菌体和暗场显微镜的大肠杆菌检测技术有望成为食品安全监测和疾病防控的重要工具，为保障公众健康提供更有力的技术支持。