蛋白质等电点测定：原理、方法与应用

蛋白质等电点测定：原理、方法与应用

蛋白质的等电点（Isoelectric Point，简称pI）是其在溶液中净电荷为零时的pH值。这一参数对于理解蛋白质的理化性质至关重要，广泛应用于生物化学、药物研发和生物医学等领域。本文将详细介绍如何测定蛋白质的等电点，重点介绍等电聚焦电泳（IEF）这一常用方法，并结合具体应用案例进行说明。

测定蛋白质的等电点具有重要的生物学和医学意义：

1. 溶解性控制：在等电点附近，蛋白质呈电中性，其溶解度最低，容易发生沉淀。因此，了解等电点有助于调节蛋白质的溶解性。
2. 电荷状态分析：蛋白质在不同pH值下带有不同电荷状态，这影响其与其他生物分子的相互作用。了解等电点有助于研究蛋白质的电荷变化。
3. 功能活性研究：蛋白质的功能通常与其电荷状态相关。知道等电点有助于优化蛋白质的功能活性。

等电聚焦电泳是测定蛋白质等电点的常用方法。其原理是利用蛋白质在含有载体两性电介质形成的连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。蛋白质分子会根据其等电点不同被分离，形成一个很窄的区带。

以等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳为例，实验步骤如下：

（一）水化上样

1. 从冰箱中取出IPG胶条，室温下放置10分钟。
2. 沿着水化槽的边缘从左向右加入样品（槽两端各1cm不加样品），中间样品液一定要连贯，不要产生水泡。
3. 用镊子轻轻撕去IPG胶条的保护层（碱性端较脆弱，应该小心操作）。
4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品液上，不要将样品液弄到胶条背面。
5. 放置40分钟，直到大部分的样品被胶条吸收，慢慢加入矿物油，防止胶条水化过程中液体蒸发。
6. 将等电聚焦仪放于-20℃，水化11-15小时。

（二）等电聚焦

1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加去离子水5-8ul。
2. 取出水化好的胶条，将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于润湿好的滤纸片上去除表面的不容物。
3. 将IPG胶条面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极精密接触。
4. 在每根胶条上滴2-3ml的矿物油。
5. 对好正负极，盖好盖子。设置等电聚焦程序。

（三）SDS-PAGE电泳

1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。
2. 配制胶条平衡缓冲液。
3. 准备厚的滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上，将另一份厚滤纸用Millio水浸湿，汲取多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。
4. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml（17cm IPG）平衡缓冲液I，在水平摇床上摇晃15分钟。
5. 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ，第一次平衡技术后，滤纸上离去多余的液体，放在平衡缓冲液Ⅱ中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
6. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将第二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。
7. 琼脂糖液体加热溶解，在100ml量筒中加入TGS电泳缓冲液。
8. 第二次平衡结束，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液，用镊子夹住胶条一端，使胶面完全浸入在电泳缓冲液中漂洗几次。
9. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入琼脂糖封胶液。
10. 注意不要在胶条下产生气泡，将胶条和聚丙烯酰胺凝胶面完全接触；放置几分钟，待琼脂糖凝固。
11. 打开二向电泳制冷仪，调温度至15℃。
12. 将凝胶电泳转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，一开始低电流，待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，加大电流，溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳；进行染色观察。

百泰派克生物科技（BTP）通过CNAS/ISO9001双重质量认证体系，建立了针对不同类别生物制品的蛋白等电点检测平台。例如，在胶原蛋白等电点检测中，一根胶条用于测试Marker以校准预制胶条的pI分布情况，另一根胶条用于测试样品。两个胶条同时进行等电聚焦以减少系统误差。

1. 样品要求：浓度＞3mg/ml；体积＞200ul；固体：质量＞200ug；纯度＞90%；含盐量＜30mM；分子量：一般要求大于1000Da。
2. 蛋白质纯度不足、含盐量过高、分子量太小等因素都可能影响测试结果。
3. 对于280nm处无吸收峰的样品（如胶原蛋白），应选择基于IEF的等电点检测方法。

蛋白质等电点的测定对于生物化学、药物研发和生物医学领域至关重要。等电聚焦电泳作为一种高效、精确的测定方法，已广泛应用于蛋白质的分离纯化、生物药物开发和质量控制等领域。随着技术的不断发展，等电点测定将在更广泛的领域发挥重要作用。