DTNB法测定谷胱甘肽含量：原理、步骤与应用

DTNB法测定谷胱甘肽含量：原理、步骤与应用

谷胱甘肽作为一种重要的抗氧化剂，广泛存在于人体细胞中。它不仅参与细胞的多种功能活动，还具有抗氧化、解毒和保护组织免受氧化损伤的作用。因此，准确测定谷胱甘肽含量对于研究细胞代谢、氧化应激和疾病机制具有重要意义。目前，DTNB法（5,5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)法）是实验室中最常用的谷胱甘肽检测方法之一。

DTNB法的检测原理基于谷胱甘肽与DTNB的化学反应。具体来说，谷胱甘肽的巯基（-SH）与DTNB反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB）和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。这一反应在pH 8.0的碱性环境中进行，生成的黄色产物在412 nm波长处有最大吸收峰，而DTNB本身在400 nm以上几乎没有吸收。因此，通过分光光度计测量412 nm处的吸光度，可以定量分析样品中谷胱甘肽的含量。

DTNB法的操作步骤相对简单，主要包括以下几个环节：

1. 样品准备：根据样品类型（如血浆、血清、组织或细胞裂解液等），进行相应的预处理。例如，细胞样品需要裂解，组织样品需要匀浆，血样需要离心分离等。

2. 标准曲线制作：配制一系列已知浓度的谷胱甘肽标准溶液，与DTNB反应后测量吸光度，绘制标准曲线。

3. DTNB贮存液和分析液的配制：

   • 将0.01 mol/L的DTNB溶解于0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）中形成DTNB贮存液。
   • 将DTNB贮存液用0.5 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液稀释100倍，配成DTNB分析液，避光放置，现配现用。

4. 反应和测量：

   • 取谷胱甘肽标准品溶液或待测样品溶液（0.1 ~ 3.0 mol/L）0.5 mL，加入到1.5 mL浓度为0.15 mol/L的NaOH溶液中，再加入3%的甲醛溶液0.5 mL，在pH 8.0、25℃下反应2 min。
   • 反应结束后，取反应液0.5 mL加入DTNB分析液，在25℃下反应5 min，于波长412 nm下测定吸收值。
   • 根据两者的吸光度，计算差值，代入标准曲线，计算出谷胱甘肽的含量。

DTNB法具有以下显著优点：

• 高灵敏度：即使在低浓度下也能准确检测谷胱甘肽。
• 操作简单：不需要复杂的仪器和步骤。
• 结果稳定：生成的有色产物稳定，重复性好。

然而，该方法也存在一些局限性：

• 干扰物质：样品中的某些还原剂（如DTT、巯基乙醇）可能影响检测结果。
• 温度敏感性：反应温度需要严格控制在25℃，否则会影响结果准确性。
• 适用范围：主要适用于液体样本，对固体样本需要进行充分的前处理。

目前市场上主流的DTNB法谷胱甘肽检测试剂盒主要由碧云天、Leagene等品牌提供。以碧云天的总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒为例，该试剂盒采用DTNB法，通过比色法检测细胞、组织或其他样品中谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性。与传统的NADPH法相比，DTNB法具有更高的检测灵敏度和线性范围，能更有效地对GPx进行酶活性定量分析。

该试剂盒包含样品匀浆液、谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液、还原型谷胱甘肽（GSH）、DTNB、DMSO和过氧化物试剂（Cum-OOH）等组分，可进行100次检测。其检测原理是利用谷胱甘肽过氧化物酶催化GSH生成GSSG，剩余的GSH与DTNB反应生成黄色产物TNB，通过测定TNB的吸光度来计算酶活性。

DTNB法以其高效、简便和准确的特点，成为了实验室测定谷胱甘肽含量的首选方法。通过DTNB法，研究人员可以快速了解样本中谷胱甘肽的含量，从而进一步探讨其在生物学过程中的重要作用。随着技术的不断进步，DTNB法在谷胱甘肽检测中的应用将更加广泛，为相关领域的研究提供有力支持。