看得更深的生物组织成像技术：1700 nm波段多光子成像

看得更深的生物组织成像技术：1700 nm波段多光子成像

深圳大学王科教授团队在《激光与光电子学进展》发表特邀封面文章，介绍了利用孤子自频移效应构建1700 nm波段飞秒脉冲光源的技术，并展示了该技术在活体小鼠脑部、皮肤结构及动力学成像中的应用。

封面解读
多光子荧光成像具有高分辨和深层成像优势，在活体生物组织中具有广泛的应用。封面展示了一种基于棒状光纤孤子自频移产生的1700 nm波段飞秒脉冲激发光源，实现了活体生物深脑多光子荧光成像的范式。利用荧光探针标记脑组织结构，同时结合1700 nm波段的激发光源实现了深脑血管和细胞的多光子荧光成像。

1. 基本原理

1.1 多光子荧光成像原理

图1（a）和（b）直观的展示了染料中的单光子荧光和双光子荧光效果。可以看到：单光子荧光在整个激发光通路上都会产生，而多光子荧光是多个激发光子与物质相互作用，其非线性的相互作用特征导致只在焦点处产生显著荧光信号，因而多光子显微成像具有本征的三维成像能力，亚微米量级成像分辨率和毫米量级成像深度[1]，如图1所示（c）所示。多光子显微成像利用近红外波段激发，有效减少组织散射的影响，从而减小激发光在传输过程中的损耗，具有更强穿透性，能够实现深层生物组织成像。

图1 单光子激发和双光子激发

1.2 光纤的孤子自频移

20世纪80年代，Mitschke和Mollenauer在反常色散的光纤中发现了孤子自频移现象[2]。他们在实验上验证了亚皮秒脉冲在光纤中形成孤子后，随着传输距离增加，孤子通过脉冲内受激拉曼散射将能量连续地从高频段传输到低频段，从而实现波长红移。实验上，只要增加输入脉冲能量，就可以实现波长的连续红移，达到波长调谐的目的。为了获得高能量的1700 nm波段孤子脉冲用于多光子成像，需要从理论上考虑孤子能量的定标关系，只考虑群速度色散和自相位调制，对应的孤子脉冲能量：
由上式可以看到：孤子能量正比于光纤有效模场面积Aeff，因此提高孤子能量一个简单有效的方法是增加光纤的有效模场面积Aeff。不同种类光纤有效模场面积以及其对应的孤子脉冲能量概括[3]，如图2所示。折射率导光型光子晶体光纤（Index guided PCF）和标准单模光纤（Standard single-mode fiber, SSMF）对应的孤子脉冲能量在nJ量级甚至更低，不适合深层成像应用。空芯光子带隙光纤（Air-core Photonic Bandgap Fiber, Aire-core PBGF）虽然非线性折射率比标准单模光纤低1000倍，导致孤子脉冲能量达到百nJ量级，但其波长调谐范围只有几十纳米。大模场（Large-mode-area, LMA）光纤和光子晶体棒状光纤（Photonic crystal rod, PC rod）的模场面积是标准单模光纤的360倍，因而孤子脉冲能量也提高3~60倍。相比空芯光纤，大模场光纤和棒状光纤产生的孤子波长调谐范围达百微米。因此，这两种光纤（绿色虚线）的更适合多光子深层成像的应用。

图2 不同光纤孤子能量和模场面积

1.3 搭建1700 nm飞秒脉冲光源

飞秒脉冲光源是多光子显微成像的基础。因此，搭建1700 nm波段飞秒脉冲光源是多光子深层脑成像的必要条件。适合1700 nm波段多光子深层脑成像的飞秒脉冲光源最早通过棒状光纤中的孤子自频移实现：利用重复率1 MHz，脉宽360 fs的1550 nm飞秒脉冲泵浦源，在Aeff=2300 μm2、长度36 cm的棒状光纤中，通过孤子自频移技术，产生了1675 nm的飞秒孤子脉冲。孤子能量67 nJ，脉宽65 fs，峰值功率达到MW。自此，棒状光纤的孤子自频移光源成为1700 nm波段深层生物组织成像的常用光源，我们在此领域开展了一系列研究工作，利用重复率MHz量级，脉宽500 fs的1550 nm飞秒脉冲泵浦源（FLCP-02CSZU, Calmar）和棒状光纤、大模场光纤以及空芯光纤搭建了不同的1700 nm波段飞秒脉冲光纤光源——线偏振孤子光源、圆偏振孤子光源、椭圆偏振孤子光源、偏振孤子合成光源、偏振复用孤子光源、空芯光纤的孤子光源以及自相位调制飞秒脉冲光源，如图所示3所示。

图3 1700 nm波段飞秒脉冲光源搭建及多光子成像

2. 应用研究

2.1 活体小鼠深层脑血管成像

脑血管成像是脑科学研究的重要应用领域。尤其长波长激发多光子荧光活体小鼠深层脑血管成像，对深脑血管成像具有重要意义。如图4所示，1700 nm激发活体小鼠深脑血管多光子荧光成像。实现了多模态多光子荧光成像最大成像深度，最大深脑血管成像达2100 μm[4]。

图4 1700 nm波段激发多光子荧光活体小鼠深层脑血管成像

2.2 活体小鼠深层血流速度测量

血流速度是反映神经细胞活动和某些脑部疾病的关键。在测量血流速度的各种方法中，多光子显微成像技术由于毫米量级成像深度和亚微米量级分辨率广泛应用于血流动力学测量。如图5a, b和d所示，采用1700 nm波段激发活体小鼠开颅和穿透头骨的最深的脑血流速度成像[5]，以及无标记的三次谐波血流速度测量[6]。

图5 1700 nm波段活体小鼠脑血流速度测量

2.3 活体小鼠深层脑细胞成像

大脑除了脑血管结构还具有大量的细胞结构，细胞和血管之间的偶联构成神经网络支配生物各种行为和生理过程。因此，重构脑细胞成像具有重要意义。如图6(a), (c) 所示，1700 nm波段激发普通活体小鼠脑星形细胞和微胶质细胞三光子荧光成像。相比双光子荧光成像深度提高，微胶质细胞成像深度达到白质层。如图6b所示，1700 nm波段激发转基因小鼠的神经细胞三光子荧光成像，成像深度突破白质层到达海马体[7]。

图6 1700 nm波段激发活体小鼠深层脑细胞三光子荧光成像

2.4 活体小鼠头骨及穿透头骨成像

在自然生理环境下观察活体小鼠脑成像对神经网络和血管成像的研究意义重大。颅窗植入，开颅和头骨打磨等手术对活体小鼠脑部造成一定的生理影响。因此，1700 nm波段三光子成像技术是穿透头骨成像的一种重要手段。如图7所示，1700 nm激发活体小鼠穿透头骨深脑血管多光子荧光成像和骨细胞三次谐波成像。采用1700 nm激发多光子荧光成像，能够获得当前多光子所有成像模态最深的穿透头骨脑血管成像。

图7 1700 nm波段活体小鼠穿透头骨三光子脑血管成像

2.5 活体小鼠深层皮肤成像

1700 nm波段激发活体小鼠皮肤多光子荧光成像，如图8所示。图8a展示了1700 nm波段的二次谐波和三次谐波成像，实现了角质层、皮脂腺、胶原蛋白和脂肪细胞等组织结构的无标记成像。图8b局部淋巴管的二次谐波和三次谐波成像。图8c展示了活体小鼠的手指皮肤的髓鞘三光子荧光成像。图8d展示了活体小鼠皮肤弹性纤维的三光子荧光成像。

图8 1700 nm波段活体小鼠多光子皮肤成像

3. 总结与展望

1700 nm波段激发多光子显微成像因其非侵入性、毫米量级成像深度、亚微米量级分辨和光学层析等优点在生物医学和脑科学研究有独特的优势。1700 nm激发活体生物深层脑成像以及皮肤成像领域获得了多光子成像技术的最大深度。
目前，1700 nm波段激发三光子荧光成像受到激发光源和荧光标记物的限制，成像深度限制在2100 μm，因此在深层生物组织成像采取自适应光学技术和开发近红外波段高亮荧光探针进一步提高活体生物深层成像。

本文原文来自《激光与光电子学进展》，作者为深圳大学王科教授团队。