屡做屡败？手把手教你运用电转染高效表达目的蛋白
屡做屡败？手把手教你运用电转染高效表达目的蛋白
电转染（Electroporation）是一种通过高强度电场作用将外源分子导入细胞的技术，在蛋白表达中具有显著优势。本文将详细介绍电转染的基本原理、操作流程及注意事项，并以CHO悬浮细胞为例进行具体说明。
电转染（Electroporation），也称为电穿孔法，是通过高强度的电场作用，使细胞膜产生短暂孔道，瞬时提高细胞膜的通透性，从而将外源核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等外源分子导入原核或真核细胞内。该项技术相比较其它物理和化学转化方法，是一种极具价值且有效的替代方法，在蛋白表达中具有显著的优势。
蛋白表达电转染操作流程及注意事项，下面以CHO悬浮细胞电转染为例。
电转染一般操作流程
前期准备
① 清洗电转杯：将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在生物安全柜内吹干，并在紫外灯下照射30min以上后备用。
② 细胞准备：电转前一至两天，将细胞以合适的密度传代，确保细胞在转染前处于对数生长期。处于对数生长期的细胞分裂旺盛，转染效率和细胞存活率较高。细胞处理
① 取样观察：对培养的细胞取样，进行细胞计数，使细胞密度至所需范围（如6-8×10^6 cells/ml），并通过镜检观察细胞状态是否良好，是否符合电转条件。
② 离心与重悬：根据实验体系要求，将细胞悬液轻轻吹打均匀后，吸取相应体积细胞悬液，进行离心（1200rpm，室温，5分钟），弃去上清，加入对应体积电转缓冲液。质粒准备
① 质粒配制：将适量质粒（根据电转仪说明书、细胞密度、实验需求计算）加入到电转缓冲液中，混匀至所需浓度。电转染
① 混合细胞与质粒：将重悬的细胞与质粒混合液轻轻混匀，避免产生气泡。
② 转移至电转杯：根据实验要求，选择相应规格电转杯，将混合液转移至清洗并干燥灭菌的电转杯中。
③ 设置电穿孔参数：根据细胞类型和实验需求，在电转仪上设置合适的脉冲电压、脉冲宽度和脉冲次数。不同细胞系需要不同的电穿孔条件，一般通过预实验确定最佳参数。
④ 进行电转：启动电转仪，进行电击操作。电击完成后，屏幕上会显示完成提示。细胞恢复与培养
① 恢复培养：将电击后的细胞悬液立即转移到预热的培养基中，置于培养箱中恢复培养。
② 根据实验需求，可在培养一段时间后（如10分钟）进行后续操作。
③ 正常培养：将细胞置于培养箱中继续培养，定期观察并记录细胞生长状态和存活情况。后续实验
检测转染效率：在适当的时间点（一般24小时或48小时后），通过特定方法检测细胞的转染效率，如荧光显微镜观察、流式细胞技术，SDS-PAGE ，Western Blot等。
电转染中常见注意事项有哪些？
- 电场强度：选取适宜的电场强度至关重要。电压过低无法有效增加膜的通透性，而电压过高则可能导致细胞死亡。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应通过预实验确定。
- 细胞状态：选择生长活跃、状态良好、无污染、低代次的细胞进行转染，以获得最佳转染效果。
- 质粒纯度：使用高纯度的质粒进行转染，确保DNA/RNA的纯度符合转染标准（A260/A280>1.8），并避免内毒素的污染，同时质粒应溶于超纯水而不是TE缓冲溶液。
- 缓冲液选择：细胞对渗透压和缓冲液的离子组成十分敏感，选择合适的缓冲液有利于提高转染效率，一般推荐使用低渗的缓冲液。
- 操作环境：电穿孔操作应在无菌环境中进行，避免污染。同时，操作过程中应尽量减少对细胞的机械损伤。
- 参数优化：不同细胞系和实验需求可能需要不同的电转参数。通过预实验优化参数，可以在保证高转染效率的同时，保持较高的细胞存活率。
- 后续培养：电击后的细胞十分脆弱，需要选择合适的培养基和条件进行恢复培养。注意观察细胞生长状态和存活情况，及时调整培养条件。