NGS技术：从个体治疗到家族预防，精准医疗的革新之路
NGS技术：从个体治疗到家族预防，精准医疗的革新之路
近年来，新一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）的快速发展正在改变癌症诊疗方式，通过大规模平行测序DNA/RNA，它能够更准确地检测出肿瘤基因变异，为患者提供个性化的靶向治疗方案。最近的研究表明，NGS不仅对个体患者的治疗有重大影响，还能揭示家族遗传风险，从而拯救几代人的生命。
NGS技术原理与优势
NGS技术，也被称为深度测序或高通量测序技术，是指能够一次性并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术。它通过对物种的基因组或转录组进行深入、细致、全貌的分析，为科学研究提供了丰富的基因序列数据。
NGS技术的基本原理是通过将多个物种的基因组放在同一个板上，然后使用定制的小核苷酸片段进行高通量的序列测定。这些小核苷酸片段会涉及到每个物种基因组序列上的每个核苷酸位点，并围绕这些位点交叉重复出现，形成一个特别的组合。结合这种组合匹配的原则，可以完成整个基因组序列的高通量测定。同时，软件程序也在核苷酸序列本身的分析上发挥重要作用，帮助完成基因组序列的准确测定。
简而言之，下一代测序是一种高通量的DNA或RNA序列测定方法。与传统的单一分子克隆和序列分析相比，它能够在短时间内批量处理样品、产生数以万计的短读段数据，并依赖高效的算法来进行比对和分析。因此，以低成本、高准确度、高通量和快速检测而成为目前最常用的基因检测手段之一。
NGS在癌症诊疗中的应用
以乳腺癌为例，NGS能精准检测关键基因（如BRCA1/2、HER2等）的突变状态，实现精准治疗和个性化医疗。通过分子分型选择最适合的治疗方案，提高疗效。
乳腺癌的常规治疗方式包括手术、放疗和药物治疗。药物治疗是乳腺癌精准治疗中的重要一环，包括化疗、激素治疗、靶向治疗和免疫治疗。其中，靶向治疗具备特异性强、疗效显著、毒副反应小等优点，已成为乳腺癌治疗的研究热点。
乳腺癌靶向治疗的选择与其分子亚型密切相关。因此，为了指导临床靶向治疗，乳腺癌患者在治疗前需要进行基因检测，明确其基因突变状态。根据患者雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）状态、人表皮生长因子受体2（HER2）和增殖指数Ki-67的表达情况，乳腺癌可分为四个亚型：Luminal A、Luminal B、HER-2过表达和三阴性乳腺癌。不同乳腺癌亚型的分子图谱有明显特异性，且标准治疗方案和预后差异较大。
随着乳腺癌分子分型的精细化和药物研发的精准化，乳腺癌的靶向治疗药物也不断推陈出新。目前与乳腺癌治疗密切相关的基因有BRCA1/2、PIK3CA、AKT、CDK4/6、HER2、ESR1等。
BRCA基因：大约10%的乳腺癌患者携带易感基因胚系致病性或可能致病性突变，其中BRCA1和BRCA2突变最为常见。①指导治疗：PARP抑制剂可有效治疗胚系BRCA突变（gBRCAm）的HER2阴性转移性乳腺癌。在OlympiA研究中，使用PARP抑制剂奥拉帕利作为gBRCAm高危HER2阴性早期乳腺癌患者的辅助治疗显示了出色的疗效。结果显示，奥拉帕利显著降低了浸润性疾病复发或死亡率，达到了研究的主要终点。4年侵袭性无病生存期（IDFS）绝对获益率达7.3%。与安慰剂相比，奥拉帕利使受试者的死亡风险降低了32%，将三年总生存（OS）率提高到92.8%（98.5% CI 0.47-0.97；p=0.009）；奥拉帕利组与安慰剂组的4年IDFS率分别为82.7%和75.4%（95% CI 3.0%-11.5%），4年远端无病生存期（DDFS）率分别为86.5%和79.1%（95% CI 3.6%-11.3%）[4]。基于上述研究结果，2022年3月，奥拉帕利成为第一个被美国FDA批准用于治疗BRCA胚系突变晚期乳腺癌的靶向药物。
HER2基因：HER2+乳腺癌是异质性极为复杂的肿瘤，约4%的乳腺癌患者携带HER2基因变异，其中点突变发生率最高为2.0%~2.4%，且不同位点突变与不同的临床意义相关。HER2点突变可能导致传统抗HER2治疗的获得性耐药，如L755S、V777L、D769Y等突变提示对曲妥珠单抗原发或继发耐药，L755S、D769Y、V842I等突变提示对拉帕替尼耐药，其中有p.L755S突变的患者表现出对曲妥珠单抗和拉帕替尼耐药。
PIK3CA、AKT、PTEN、CDK4/6基因：研究发现，PI3K/AKT/mTOR信号通路在乳腺癌中广泛激活，促进了乳腺癌的发生发展[6]。同时该通路激活也与内分泌治疗、靶向治疗的耐药密切相关。乳腺癌NCCN指南（2024 V1）推荐，对于PIK3CA或ATK1或PTEN突变的HR+/HER2-绝经后乳腺癌患者，二线治疗推荐Capivasertib联合氟维司群（Ⅰ级推荐）[7]。此外，PIK3CA基因突变可作为预测ER+乳腺癌PI3Kα特异性抑制剂阿培利司疗效的敏感性标志物。CDK4/6突变状态则能提示内分泌用药选择，且CCNE1高表达、Rb缺失、TK活性等在预测CDK4/6抑制剂疗效中也具有潜在价值。
ESR1基因：ESR1的基因状态可提示激素阳性乳腺癌患者治疗方案的选择和预后。**《基于靶标指导乳腺癌精准治疗标志物临床应用专家共识（2022版）》[3]指出，ESR1突变是ER+乳腺癌继发性耐药的重要机制之一，也是预后不良的指标。**2023年Journal of Clinical Oncology在线发表了对于HR+/HER2-晚期乳腺癌生物标志物检测的ASCO指南更新，增加了ESR1突变作为指导HR+/HER2-晚期乳腺癌的生物标志物，推荐这部分患者进行常规检测[8]。
NGS在家族遗传风险检测中的作用
研究显示5%的健康受试者携带致病性变异，通过NGS可以及早发现遗传性癌症风险，实现早期预防。
由胚系突变引起的遗传性癌症综合征占所有癌症的5-10%。该基因突变的发现可能对药物治疗、个性化预防策略和级联检测产生深远影响。根据美国国家综合癌症网络（NCCN）和意大利肿瘤医学协会（AIOM）的指南，只有在患者无法获得的情况下，未患病的家庭成员才应接受检测。本文探讨了即使在缺少在世患病亲属的情况下，是否仍可以为高风险家庭提供遗传性癌症相关的胚系基因检测。
2017年至2023年，对103名健康受试者进行了回顾性研究。研究者纳入了至少有两名一级或二级亲属患乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌或结直肠癌的所有受试者。采用二代测序（NGS）技术对所有受试者进行27个肿瘤相关基因的多基因panel检测。在研究人群中，发现致病性/可能致病性变异（PVs/LPVs）5个（约5%），意义未明变异（VUS）40个（42%）。这项研究强调了对有明显遗传性恶性肿瘤家族史的个体进行基因检测的重要性。这种方法将使检测结果呈阳性的个体能够根据其个人突变状态接受量身定制的治疗和预防策略。在个体化医疗时代，对无幸存的受影响亲属的健康人进行基因检测，对于早期诊断、临床监测和手术选择至关重要。
NGS技术的最新进展
NGS技术不断发展，读长和数据量显著提升，成本降至1000美元/人，已在临床诊断中广泛应用。
随着人类基因组计划（human genome project）在2003年顺利完成，基因组测序技术取得了长足的进步，这直接导致了每兆基因组成本的大幅下降以及检测的基因组数量越来越多。人们对基因组的复杂性深感震惊，这也引导着测序技术的进一步发展。最近的一些突破性技术使得测序技术在更短的时间内可以获得更多的数据量。与之对应的是，还有一些技术的进步使得单条序列的测序读长变得更长——这对解析结构性的复合区段是极其必要的。这些进展给科研人员以及医疗诊断人员提供了一个绝佳的平台使得人们对基因组变异导致的表型变化以及疾病发生有了进一步的了解。
近日，美国冷泉港实验室联合加州大学戴维斯分校的研究人员在国际著名评论型综述杂志Nature Reviews Genetics（影响因子41）上发表了一篇评论型综述。该综述对高通量测序的技术原理以及各平台的优势比较和实践应用进行了深入浅出的分析。
介绍
自从DNA的双螺旋结构被人们解析开始1，人们在探究健康与疾病的基因组的复杂性与差异性上做出了巨大的努力。为了支持人类基因组计划的顺利进行2，人们在仪器和试剂上做出了巨大的改进。该计划的完成使得人们强烈的意识到人们需要更多更好的技术与数据分析能力来回答随之而来的一系列生物学问题。然而，通量的限制以及居高不下的测序成本成为了人们进一步了解基因组的一道坎。2000年之后推出的高通量测序平台很好地解决了这个问题，人类基因组测序的成本直接因此下降50000倍，并且由此产生了一个新的名词：下一代测序（next-generation sequencing，NGS）3。在过去的十年中，NGS技术不停的在进步——测序的数据量增加了100-1000倍4。这些技术上的进展使得人们甚至可以在一条read上读出整条基因组序列。根据Veritas Genomics的数据5，人类基因组测序的成本也已经下降到1000美元/人。不仅如此，该技术已经广泛在临床诊断上得到应用3,6。
但是，尽管NGS技术非常重要，却并非完美。与NGS技术一道出现的是该技术带来的一系列问题。NGS可以提供海量的数据量，但是其质量却有待提高（有报道，NGS在序列拼接过程中，错误率在0.1-15%范围内），并且NGS的序列读长普遍较低（每条read的长度在35-700bp之内7，这比普通的Sanger测序要短），这意味着需要更严格复杂的序列拼接。尽管长读长测序可以克服NGS的这一大弱点，但相对而言，成本较高并且通量较低，这也限制了该技术的进一步应用。最后，NGS同时还和其他的技术之间存在着竞争的关系。
短读长（read）的NGS测序
测序模版克隆法生成综述
短读长测序方法包含两种：边连接边测序（sequencing by ligation, SBL）以及边合成边测序（sequencing by synthesis, SBS）。在SBL方法中，带有荧光基团的探针与DNA片段杂交并且与临近的寡核糖核酸连接从而得以成像。人们通过荧光基团的发射波长来判断碱基或者其互补碱基的序列。SBS方法通常使用聚合酶，而且，诸如荧光基团在链的延伸过程中被插入其中。绝大多数的SBL和SBS方法，DNA都是在一个固体的表面上被克隆。一个特定区域内成千上万个拷贝的DNA分子可以增加信号和背景信号的区分度。大量的平行同样对上百万的reads的读取大有帮助，每个平行只有唯一的DNA模板。一个测序平台可以同时从上百万的类似反应中读取数据，因此可以同时对上百万的DNA分子进行测序。
产生模板的克隆有几个方法：基于磁珠（bead-based），固相介质（solid-state）以及DNA微球技术（DNA nanoball）（图1）。DNA模板产生的第一步就是样本DNA的片段化，接着是连接到一个为了克隆和测序而设计的接头上。在磁珠法的准备过程中，一个接头和寡核糖核酸片段互补并且固定在珠子上（图1a）。DNA模板通过使用油包水PCR（emulsion PCR，emPCR）8得以扩增。单个珠子上被克隆得到的DNA片段可以达到上百万个9。这些珠子可以被分为glass surface10或者PicoTiterPlate（罗氏诊断）11。固相介质扩增12避免了油包水PCR，取而代之的是在固相介质上直接进行PCR13（图1b,c）。该方法中，正向和反向引物结合在芯片的表面，这些引物给单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）提供了末端的互补序列供其结合。最近，几个NGS的平台都是用了模块化的flow cells。
BGI使用的Complete Genomics technology测序技术是唯一一个在溶液中完成模板富集的技术。在这种情况下，DNA被多次连接，成环以及剪切从而为了产生一个包含4个不同接头的环状的模板。通过旋转环状扩增（rolling circle amplification，RCA），可以最多产生超过200亿的DNA微球（图1d）。微球混合物随后被分配到芯片表面上，使得每个微球可以占据芯片的一个位点14。
边连接边测序（SOLiD和Complete Genomics）
从根本上来说，SBL法包含了杂交和对标记的探针的连接15。探针包含了一到两个特定碱基序列和一系列通用序