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易错PCR技术详解:原理、方法与注意事项

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易错PCR技术详解:原理、方法与注意事项

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1
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1.
https://www.biomart.cn/72033/news/3224732.htm

易错PCR技术是一种基于PCR扩增时存在错配率的原理而获得突变基因的技术。通过改变PCR条件,可以提高扩增产物的碱基错配率,从而获得与原来不同的DNA序列或基因。本文将详细介绍易错PCR技术的原理、实现方法以及注意事项。

易错PCR技术的原理

易错 PCR技术(Error-prone PCR, epPCR)是基于PCR扩增时存在错配率为原理而获得突变基因的技术,一般PCR错配率为10-6~10-5。碱基错配虽然降低了DNA序列复制的保真度,但对获得新DNA序列提供了一种可利用的方式。于是,便出现了易错 PCR技术(Error-prone PCR, epPCR) 。易错PCR可以通过改变PCR条件,提高扩增产物的碱基错配率,从而获得与原来不同的DNA序列或基因。

作为一种有效地获得变异DNA序列的技术,易错PCR主要是针对特定的基因,这在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景。易错PCR改变蛋白基因序列后,通过表达及定向筛选,获得满足工业医学需要的耐热、耐碱及耐盐性能的蛋白酶。在植物的遗传、育种研究中,最缺乏的已经不再是转基因和常规杂交的手段,而是缺乏优异基因。有了专一性优异基因,农业中的高产、抗逆、抗病虫、抗除草剂等新品种、新材料就会快速脱颖而出。

但可能对于PCR原理研究不深的小伙伴可能会提出疑问,是不是易错PCR这个技术很难实现,或者需要商品化试剂套件?

提高碱基错配率的方法

其实易错 PCR技术目前可采用多种方法提高DNA聚合酶的碱基错配率,并稳定非互补碱基对。基于PCR基本原理和和反应体系相关组分功能,改变PCR反应条件的主流方法主要有以下4种:

  1. 使用保真度相对较低Taq酶、并加大Taq酶用量;
  2. 调整反应体系中4种dNTP的浓度,使之非1:1:1:1的平衡浓度关系;
  3. 在反应体系中加入一定量的Mn2+;
  4. 增加反应体系中的Mg2+浓度。

了解大概调整方向后,进一步与大家分享常规的PCR 100 µL反应体系组成:

不同体系调整可能使得变异错配具有偏好性,像Leung等学者提出的易错PCR体系中,易错 PCR 的变异带有强烈的偏好性,即AT→GC的变异率明显高于GC→AT的变异率。后在Cadwell 和 Joyce等学者研究的修正体系中AT→GC与GC→AT 变异比率接近。这样,基因的诱变文库会有更好的多样性,并且不会造成不同碱基含量的显著变化。

目前常用的标准易错 PCR方法是参考以下方案:

退火温度的基本设计原则是宜低不宜高;反应不进行热启动和末端延伸。

易错PCR诱变出现的最多变异类型是点突变,删除引起的移框突变也偶有出现。即在易错PCR诱变体系中,Mg2+浓度提高4.7倍,Taq DNA聚合酶提高2倍,添加Mn2+,提高5倍的一种或两种dNTP浓度。按以上标准易错 PCR体系进行诱变,可构建无序列倾向性的基因随机点突变库,每个核苷酸的突变率约为6.6 ×10-3。

提高诱变率的其他方法

一般增加dATP和dTTP浓度时,宜选择含有Co2+的Buffer;而增加dCTP和dGTP 浓度时,宜选择含有Mn2+的Buffer。PCR反应缓冲液中的K+有利于扩增大于500 bp长度的DNA片段。

增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP;使用5 mmol/L MgCl₂ 、0.5 mmol/L MnCl₂、dTTP和dCTP浓度提高到1 mmol/L的条件下,经2轮PCR (共60个循环)碱基错配率可达2.4%。其突变类型有明显偏向性,以A/T的突变为主,转换多于颠换。

此外,降低起始模板浓度、增加每个循环的延伸时间、提高反应体系pH值、增加循环次数、参与离子等也都可以明显调整提高诱变率。几种方法可单独使用,但更多的时候是综合使用,以求最简单、快捷的得到更多的突变子。

注意事项

  1. 控制碱基突变的倾向性或偏好性;
  2. 易错PCR产量及变异频率;
  3. 模板尽量只含靶标基因区段;
  4. 需综合可优化条件较多,建议从Taq酶基本性质入手,可以重点关注Mg2+依赖性和几种变性抑制剂(如醇类)对于酶的错误率有很大影响因素,简化诱变条件,优先选择高效的调整因素尝试。
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