质粒抽提实验操作指南：从基础步骤到疑难杂症解决方案

质粒抽提实验操作指南：从基础步骤到疑难杂症解决方案

引用

搜狐

1.

https://www.sohu.com/a/826276532_120439956

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介，这种基因运载工具在基因工程中具有极其广泛的应用价值。而想要从细菌中获得质粒DNA，需要通过质粒抽提的方法。在研究基因功能时，无论是过表达，还是基因敲除，都需要构建载体并转化到大肠杆菌，摇菌扩增后，提取细菌质粒从而用于后续实验。

质粒抽提步骤

以下实验步骤以某品牌质粒抽提试剂盒为例：

1. 准备阶段

• 细菌培养：挑取单克隆在含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，选择处于对数生长期的菌体离心收集，去除培养基。

2. 重悬裂解菌体

• 菌体重悬：向菌体沉淀中加入Buffer S1，吸打或振荡彻底悬浮菌体。
• 菌液裂解：向菌液中加入Buffer S2，以破坏细胞膜并释放质粒DNA。此过程温和混匀，确保裂解液均匀分布。

3. 中和裂解液

• 中和反应：加入酸性缓冲液Buffer S3，中和碱性环境，使蛋白质沉淀下来。此过程轻轻重复颠倒以促进蛋白质沉淀。

4. 离心沉淀

• 通过高速离心，吸取上清溶液去除沉淀。

5. 亲和纯化

• 柱层析：使用亲和层析柱吸附质粒，再通过Wash Solution洗脱步骤去除杂质。该过程结束后要注意乙醇挥发要彻底。

6. 洗脱重组质粒

• 洗脱缓冲液：使用无菌水或EB缓冲液洗脱质粒DNA，测量浓度后放置-20℃保存。

质粒抽提是一项常见的分子生物学实验，尽管步骤相对简单，但是在实际操作中总会面临着抽提浓度较低，纯度较差的现象。以下总结了一些可能的影响因素及其解决方案。

质粒抽提常见问题和解决方案

1. 大肠杆菌老化

• 控制摇菌时间，摇培12-14 h的菌更多的处于对数生长期，不能因为想得到高浓度的质粒而增加摇培时间，细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解。

2. 质粒拷贝数低

• 当使用pET等低拷贝载体时，由于载体拷贝数影响导致质粒DNA提取量低，可以使用更多的菌量分开收集裂解再统一纯化或统一收集，但需要相应增加溶液使用量。

3. 菌盘放置时间过长

• 用于质粒抽提的单克隆应当是新鲜涂盘生长的，刚活化的菌比-80℃保存菌种所培养来的菌液状态好，并且保存时间过长的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。

4. 菌液摇晃时间不足

• 注意菌液培养时间，一般为12-14 h，若培养时间不足会导致菌体生长不充分，造成提取浓度较低。

5. 菌体量过大

• 选择适宜的菌液体积，一般推荐1.5-5 ml菌液。菌液体积不是越多越好，也要考虑裂解试剂的添加量，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率，并且未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

6. 裂解不充分，操作不仔细

• 菌体沉淀中加入Buffer S1，吸打或振荡彻底悬浮菌体，注意避免大量气泡的产生，菌体悬浮后若有较多的气泡会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。加入Buffer S2上下颠倒混匀，此过程温和缓慢，确保裂解液均匀分布。不要剧烈震荡，以免基因组DNA断裂污染质粒。所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。

7. 加入Buffer S3避免剧烈摇晃

• 加入Buffer S3后会立刻产生絮状沉淀，温和上下颠倒5-10次，不要剧烈的摇动，否则会造成质粒和蛋白铰链降低产量，如果起始菌液较多，混匀后室温静置2-5min。

8. 分离上清和沉淀时误吸到絮状沉淀

• 将Buffer S3处理后的菌液通过高速离心分离，通过使用大枪头和小枪头叠加的方式吸取上清溶液，避免误吸到絮状沉淀，若吸取失误可将吸取后的上清溶液再次离心分离。

9. 溶液使用不当

• 注意质粒抽提中各试剂的存放温度，Buffer S1试剂由于具有RNase A，储存于2-8℃，Buffer S2和Buffer S3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃温浴直至澄清，待冷却至室温后使用。

10. 吸附柱过载

• 不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基 (如SOC或SOB) 或宿主菌生长率较高，则须减少菌液用量。吸附柱过载可能会导致堵孔，从而影响质粒的回收。

11. 质粒未完全溶解

• 洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1 min可达到较好的效果。如果是低拷贝质粒或质粒大于8 kb时，可以延长放置时间，让DNA完全溶解后再洗脱，可以提高洗脱效率。

12. 洗脱次数不足

• 质粒洗脱回收中可以重复回收2次，并注意在操作过程中枪头无需轻易更换。

13. 乙醇残留

• 漂洗液洗涤后应空甩离心尽量去除残留液体。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 (酶切、PCR等) 实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，可放到烘箱烘干或超净台上风吹5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇溶液。

14. 洗脱液位置添加不准确

• 洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。若第一次没有将洗脱液准确加到硅胶膜的中心部位，可以离心后将离心下来的洗脱液按正确方式重新上柱再次洗脱。

15. 洗脱液体积不合适

• 洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。使用小于40 μl的洗脱液可以得到浓度更高的DNA，但得率显著降低，同时洗脱体积过大，也会影响质粒的回收效率。

16. 洗脱液类型选择

• DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致回收浓度较低。

17. 洗脱液可以加热处理

• 洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。