LiP-MS最详尽的实验及分析流程

LiP-MS最详尽的实验及分析流程

引用

CSDN

1.

https://blog.csdn.net/Specally/article/details/145000005

蛋白质之间的相互作用在生物活动中扮演着至关重要的角色。无论是细胞内的信号传导、酶活性调控、蛋白质复合物的组装，还是小分子药物与其靶标蛋白的结合，这些过程都依赖于蛋白质间的相互作用。因此，深入研究蛋白质间的相互作用对于理解生命活动的分子机制具有重要意义。

近年来，有限蛋白酶解-质谱法（Limited Proteolysis–Mass Spectrometry, LiP-MS）作为一种新兴的技术，为研究蛋白质相互作用提供了强大的工具。LiP-MS的独特优势在于，它无需对蛋白质进行化学修饰即可识别相互作用位点，从而能够在天然状态下检测蛋白质组范围内的代谢物-蛋白质相互作用。此外，LiP-MS还被广泛应用于药物-蛋白质相互作用的研究，成为药物靶点发现的重要方法之一。

接下来，我们将详细介绍LiP-MS的实验流程、数据分析方法以及实验中的关键注意事项，希望能为您的实验提供有价值的参考和帮助。

LiP-MS 实验流程

LiP-MS的基本原理及实验流程如下图所示。首先，将代谢物或小分子药物以单一浓度或多个浓度与天然状态下的细胞裂解物共同孵育。随后，短暂暴露于非特异性蛋白酶（如蛋白酶 K）进行有限酶切。由于代谢物或小分子药物与蛋白质的结合可能导致蛋白质构象的改变，这种构象变化会影响蛋白酶的切割位点可及性，从而在有限的蛋白酶解过程中产生靶蛋白的特异性片段。接下来，使用胰蛋白酶对这些蛋白质片段进行进一步消化，生成适合定量质谱分析的肽段。通过比较代谢物处理样品与未处理样品中肽段的丰度差异，可以识别出与代谢物或小分子药物结合的蛋白质及其作用位点。

LiP-MS方法包括两种实验设计：单剂量实验（LiP–SMap）和多剂量实验（LiP–Quant）。LiP–SMap主要用于系统性地检测代谢物与蛋白质的相互作用，适用于快速筛选和初步鉴定；而 LiP–Quant则通过多剂量实验结合机器学习框架，能够更精确地优先考虑小分子药物的真实蛋白质靶点，适用于深入研究和药物靶点验证。这两种方法相辅相成，为研究蛋白质-代谢物及蛋白质-药物相互作用提供了灵活且高效的工具。

具体实验流程

1. 细胞裂解：

   1. 根据不同类型的样本（如细菌、酵母、哺乳动物细胞等）采取相应的提取方法。在整个提取过程中，需使用新鲜样本；若使用冻存样本，则样品制备过程需在冰上进行，以保持蛋白质的天然状态。
   2. 使用适当的裂解缓冲液（如LiP缓冲液：100mM HEPES pH 7.4, 150 mM KCl, 1 mM MgCl₂）进行细胞裂解。
   3. 裂解后，通过离心去除细胞碎片，并使用凝胶过滤柱去除内源性代谢物和核酸，以提高实验的信噪比。
   4. 采用喹啉甲酸（BCA）测定法测定裂解物的蛋白浓度，并将蛋白浓度调整至2µg/µL，以确保后续实验的标准化。

2. 代谢物/药物孵育：

   1. 将代谢物或小分子药物以单一浓度（LiP–SMap）或多个浓度（LiP–Quant）与细胞裂解物共同孵育。
   2. 孵育时间通常为5分钟，温度为25°C，以确保代谢物或药物与蛋白质充分结合。

3. 有限蛋白酶解：

   1. 在孵育后的裂解混合物中加入非特异性蛋白酶（如蛋白酶K）进行有限酶切，酶切时间通常为5分钟，酶与蛋白的比例为1:100（wt/wt）。
   2. 酶切后，通过加热（99°C，3分钟）灭活蛋白酶，终止反应，并迅速冷却样品至4°C，以防止样品蒸发。

4. 蛋白质片段消化：

   1. 使用胰蛋白酶对蛋白质片段进行进一步消化，生成适合质谱分析的肽段。
   2. 消化通常在37°C下进行，持续2小时至过夜，以确保蛋白质片段被充分消化为肽段。

5. 样品制备：

   1. 通过酸沉淀去除去氧胆酸钠（DOC），并使用C18树脂进行肽段脱盐，以去除样品中的杂质。
   2. 脱盐后的肽段通过SpeedVac干燥，并重新溶解于0.1%甲酸溶液中，以备质谱分析。

6. LC-MS/MS 分析：

   1. 使用高分辨率质谱仪进行数据依赖采集（DDA）和数据独立采集（DIA）分析。
   2. 通过液相色谱（LC）分离肽段，质谱（MS）检测肽段的质量和丰度。
   3. 质谱分析时，建议使用线性梯度（3%至30%乙腈）进行肽段分离，并在正离子模式下进行数据采集，以确保高灵敏度和高分辨率的检测结果。

LiP-MS数据分析过程

1. 谱库生成：使用Spectronaut软件生成肽段谱库，为后续的定量分析提供参考。谱库的生成基于数据依赖采集（DDA）和数据独立采集（DIA）的质谱数据，确保覆盖广泛的肽段信息。

2. 定量分析：对DIA数据进行定量分析，比较代谢物处理样品与未处理样品中肽段的丰度差异。通过Spectronaut软件进行肽段定量，生成差异丰度肽段列表。使用LiP–Quant机器学习框架 计算LiP–Quant分数，该分数结合了剂量-响应相关性分析、蛋白质频率库（PFL）信息、肽段统计显著性等多个特征，优先筛选出真实的蛋白质靶点。

3. 结果验证：通过正交实验（如生化实验或结构生物学方法）验证LiP-MS鉴定的蛋白质-代谢物或蛋白质-药物相互作用。常用的验证方法包括：生化实验、结构生物学方法、功能实验等。

通过上述分析流程，LiP-MS 能够系统性地识别和验证蛋白质-代谢物或蛋白质-药物的相互作用，为药物靶点发现和代谢调控研究提供了可靠的数据支持。作为一种强大的结构蛋白质组学方法，LiP-MS不仅能够在天然状态下高效检测蛋白质与小分子之间的相互作用，还能够在不依赖化学修饰的情况下精确识别结合位点，为复杂生物系统中的分子机制研究提供了全新的视角。

LiP-MS在药物开发和代谢调控研究中展现出广阔的应用前景。通过结合单剂量（LiP–SMap）和多剂量（LiP–Quant）实验设计，研究人员能够快速筛选药物靶点并评估其结合亲和力，为药物设计和优化提供关键信息。此外，LiP-MS还能够揭示代谢物与蛋白质之间的相互作用网络，为代谢疾病的机制研究和治疗策略开发提供重要线索。

未来，随着技术的不断优化和应用范围的拓展，LiP-MS有望在生物医学领域发挥更大的作用，推动药物发现、代谢调控以及个性化医疗的发展。