ELISA实验原理操作详细介绍和Protocol解决方案及其应用

ELISA实验原理操作详细介绍和Protocol解决方案及其应用

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种广泛应用于基础科学研究、临床应用研究和诊断的免疫学检测方法。本文将详细介绍ELISA的原理、类型、实验方案及其应用，帮助读者更好地理解和掌握这一重要实验技术。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种广泛用于基础科学研究、临床应用研究和诊断的免疫学检测方法。

原理：

ELISA技术依赖于抗原（即靶蛋白）与针对目标抗原的一抗之间的相互作用，通过酶联抗体催化添加的底物来确认抗原的存在。

在ELISA中，将具有特定结合特性的液体样品添加到反应室或微孔板内的固定固相上。然后，依次孵育不同的液体试剂，从而在最终液体中产生一些光学变化（例如，通过酶促反应产物的颜色变化）。其结果可以通过目视检查定性检测，也可以使用光度计或分光光度计的读数定量检测[1][2][3][4]。

常见的三种ELISA类型

常见的三种ELISA类型包括直接ELISA、间接ELISA和夹心ELISA。

图 1. 常见的三种ELISA类型[1]

a. 直接ELISA依赖于酶偶联的一抗与抗原包被板的结合。
b. 间接ELISA引入了对与抗原包被板结合的一抗具有特异性的酶联二抗。
c. 夹心ELISA技术包括将样品抗原引入抗体预包被的板中，然后检测和酶联二抗依次结合到抗原上的识别位点。

ELISA的实验方案

ELISA实验通常分为几个步骤：包被、封闭、孵育、检测和结果分析。接下来，我们将详细介绍这三种ELISA类型的实验方案。

直接ELISA

直接ELISA是检测抗原的最简单的方案。

将含有分析物的缓冲溶液加入96孔板中，让其粘附在塑料板上一段时间（图2a）。在直接ELISA中，加入带有偶联酶的一级检测抗体，该抗体与覆盖孔的抗原结合（图2b）。将板孵育足够长的时间以使抗原-抗体结合，并用磷酸盐缓冲盐水清洗以去除多余的抗体，然后加入酶的底物，在黑暗环境中等待酶-底物相互作用，然后用特定溶液停止反应。酶-底物相互作用导致颜色形成，可通过微孔板读数器检测到（图2c）。分析时，将样品读数与标准曲线进行比较。

图 2. 直接ELISA方案[3]

基本操作：

1. 包被：

• 包被抗原：向每孔加入50-100μL预设浓度的抗原，封板后于4°C孵育过夜。
• 洗涤：使用ELISA洗板机，用0.05%PBST缓冲液洗涤板三次。通过吸出或倒置板来填充和排空孔，以去除溶液。

2. 封闭：

• 封闭：用含3%BSA的PBS缓冲液以100-200μL/孔的量封闭板，封板后于室温孵育1小时。
• 洗涤：按照步骤（2）进行洗涤。

3. 孵育：

• 加入抗体偶联物溶液：加入抗体偶联物溶液（Ab-HRP），使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，在含0.5%BSA的0.05%PBST缓冲液中进行两倍系列稀释（至少三个稀释度）。每个稀释度做三次重复。封板后于室温孵育1小时。
• 洗涤：去除溶液，并使用ELISA洗板机，用0.05%PBST缓冲液洗涤板六次。
• 显色：加入TMB底物溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，于室温孵育7分钟或直至达到所需的颜色强度（标准品应出现明显的梯度）。
• 终止反应：向每孔加入50μL2MH2SO4溶液来终止反应。

4. 检测分析：

• 读板：使用具有适当硬件的ELISA板读数器测量吸光度。
• 数据分析

间接ELISA

在间接ELISA中，抗原固定（图3a）、封闭和洗涤后，加入与抗原结合的一抗（图3b）。将载体在封闭缓冲液中孵育，使封闭缓冲液稀释的一抗结合到载体上，并用洗涤缓冲液洗涤，然后加入封闭缓冲液和带有酶标的第二抗体（图3c）。与直接ELISA类似，进行再次孵育、洗涤，加入底物，并使用微孔板读数器扫描孔（图3d）。

第二抗体也可以用荧光素标记，并使用荧光计在紫外光下对结果进行量化。这种方法称为荧光联免疫吸附试验（Fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA）。

图 3. 间接ELISA方案[3]

基本操作：

1. 包被：

• 包被抗原：向每孔加入50-100μL预设浓度的抗原，封板后于4°C孵育过夜。
• 洗涤：使用ELISA洗板机，用0.05%PBST缓冲液洗涤板三次。通过吸出或倒置板来填充和排空孔，以去除溶液。

2. 封闭：

• 封闭：用含3%BSA的PBS缓冲液以100-200μL/孔的量封闭板，封板后于室温孵育1小时。
• 洗涤：按照步骤（2）进行洗涤。

3. 孵育：

• 加入一抗：加入一抗溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，在含0.5%BSA的0.05%PBST缓冲液中进行两倍系列稀释（至少三个稀释度）。每个稀释度做三次重复。封板后于室温孵育1小时。
• 洗涤：按照步骤（2）进行洗涤。
• 加入二抗：加入二抗溶液，如Goat Anti-Human IgG H&L（HRP），稀释于含0.5%BSA的0.05%PBST缓冲液中，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积。封板后于室温孵育1小时。
• 洗涤：去除溶液，并使用ELISA洗板机，用0.05%PBST缓冲液洗涤板六次。
• 显色：加入TMB底物溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，于室温孵育7分钟或直至达到所需的颜色强度（标准品应出现明显的梯度）。
• 终止反应：向每孔加入50μL2MH2SO4溶液来终止反应。

4. 检测分析：

• 读板：使用具有适当硬件的ELISA板读数器测量吸光度。
• 数据分析

应用

• 即时HIV检测（Point-of-care HIV testing）：测试棒上标有HIV抗原，血液样本放在测试棒的末端。缓冲液允许任何抗体沿着棒子流动，并附着在抗原上。用抗人抗体（二抗）清洗，用偶联酶标记，然后用染料清洗。颜色的变化代表积极的结果[3]。

夹心ELISA

夹心ELISA可分析更复杂的溶液。其名称源于该装置能够将抗原“夹”在两种抗体之间（图4）。将含有捕获抗体的包被缓冲液加入孔板中并使其粘附（图4a）。孵育后，清洗孔板并加入封闭缓冲液以封闭孔上任何剩余的结合位点。然后将样品加入每个孔中并孵育特定时间（图4b）。为确保结果的准确性，必须对每个孔板运行标准样品（阳性对照）和空白样品（阴性对照）。然后将检测抗体加入每个孔中（图4c），随后加入偶联的二抗和封闭缓冲液（图4d）。在每个步骤之间，用磷酸盐缓冲盐水清洗孔。加入底物溶液并使用微孔板读数器检测结果（图4e）。

图 4. 夹心ELISA方案[3]

基本操作：

1. 包被：

• 包被捕获抗体：向每孔加入50-100μL预设浓度的捕获抗体，封板后于4°C孵育过夜或在室温下孵育2小时。
• 洗涤：在ELISA洗板机中用0.05%PBST缓冲液洗涤三次。通过吸出或倒置板来填充和排空孔，以去除溶液。

2. 封闭：

• 封闭：使用含3%BSA的PBS缓冲液（100-200μL/孔）封闭板，封板后于室温孵育1小时。
• 洗涤：按照步骤（2）进行洗涤。

3. 孵育：

• 加入标准品和样品：向每孔加入50-100μL标准品和样品，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，在含0.5%BSA的0.05%PBST缓冲液中进行两倍系列稀释（至少三个稀释度）。每个稀释度做三次重复。封板后于室温孵育2小时。
• 洗涤：去除溶液，并在ELISA洗板机中用0.05%PBST缓冲液洗涤六次。
• 加入一抗：加入另一种针对待测抗原不同表位的特异性检测抗体，稀释于含0.5%BSA的0.05%PBST缓冲液中，50-100μL/孔，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积。封板后于室温孵育1小时。
• 加入二抗：加入二抗溶液，如Goat Anti-Human IgG H&L（HRP），稀释于含0.5%BSA的0.05%PBST缓冲液中，50-100μL/孔，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积。封板后于室温孵育1小时。
• 洗涤：去除溶液，并在ELISA洗板机中用0.05%PBST缓冲液洗涤六次。
• 显色：加入TMB底物溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，于室温孵育7分钟或直至达到所需的颜色强度（标准品应出现明显的梯度）。
• 终止反应：向每孔加入50μL2MH2SO4溶液来终止反应。

4. 检测分析：

• 读板：使用具有适当硬件的ELISA板读数器测量吸光度。
• 数据分析

应用

• 家用妊娠试剂盒（Point-of-care pregnancy testing）：使用夹心ELISA法快速提供与患者相关的结果。试纸条含有抗β人绒毛膜促性腺激素（抗βhCG）和结合抗体，这些抗体与尿液样本中的βhCG发生反应。用自来水冲洗试纸条以去除任何未结合的样本，并与底物试剂一起孵育几分钟。颜色信号的存在和强度与样本中的βhCG量成正比，可用于估计妊娠周龄。

如何做出更好的ELISA实验？

想要做好一个ELISA实验，确保结果的准确性和可靠性，除了基本的实验步骤外，还需要注意一系列细节和考虑因素。以下是补充的一些ELISA实验小细节：

表2. 实验失败的可能性原因及解决方案[3]。

小结

本文介绍了ELISA实验的相关知识，从原理、类型、Protocol、应用等方面进行了详细的阐述。对于从事相关领域研究的读者具有较高的参考价值。

参考文献

[1] Konstantinou GN. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2017;1592:79-94.

[2] Hornbeck P, Winston SE, Fuller SA. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Curr Protoc Mol Biol. 2001 May;Chapter 11:Unit11.2.

[3] Tabatabaei MS, et al. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2022;2508:115-134. doi: 10.1007/978-1-0716-2376-3_10. PMID: 35737237.

[4] Hayrapetyan H, et al. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Types and Applications. Methods Mol Biol. 2023;2612:1-17.