一文看懂激光共聚焦显微镜（CLSM）

一文看懂激光共聚焦显微镜（CLSM）

激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）是一种高性能的光学显微成像技术，它通过使用激光作为光源，结合共轭空间针孔滤波器，排除了非焦点平面的散射光，从而大幅提升了图像的分辨率和对比度。CLSM能够进行高分辨率的二维和三维成像，适用于观察细胞结构、分子定位以及实时动态过程等。

发展历史

CLSM的概念最早由Marvin Minsky在1957年提出，但直到20世纪80年代初期，商业化的CLSM才正式推出。最初的CLSM在技术上并不完善，但随着光学系统设计的不断改进，成像质量和灵敏度都有所提高。进入90年代，CLSM系统中引入了混合激光和紫外激光技术，使得CLSM的功能不断升级，应用领域也随之扩展。

功能与应用

CLSM的主要功能包括光学切片、三维图像重建、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定等。它在生物学、医学研究中非常重要，特别是在形态学、分子生物学、神经科学、药理学等领域，CLSM提供了观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的强大工具。

分类

点扫描共聚焦显微镜（Point Scanning Confocal Microscopy）

原理
点扫描共聚焦显微镜使用激光作为光源，通过一个微小的光束扫描样品。样品中的荧光分子在激光激发下发光，这些荧光信号通过一个针孔被检测，只有来自焦平面的荧光信号能够通过针孔到达探测器。这样可以有效排除焦平面以外的信号，提高图像的分辨率和对比度。

应用优缺点
点扫描共聚焦显微镜因其高分辨率和良好的光学切片能力而广泛应用于细胞生物学和组织学研究。它能够提供高质量的三维图像，适用于固定细胞和组织的详细结构分析。然而，点扫描共聚焦的成像速度相对较慢，光毒性较强，可能不适合长期或高速的活细胞成像，及大组织样本的数据采集。

转盘共聚焦显微镜（Spinning Disk Confocal Microscopy）

原理
转盘共聚焦显微镜使用一个带有微透镜阵列的转盘来增加照明效率和采样速率。多个针孔同时工作，与点扫描相比，转盘共聚焦可以提供更快的成像速度和较低的光毒性，适合活细胞成像和长时间观察，快速获得共聚焦分辨率的切片扫描数据。

应用优缺点
转盘共聚焦显微镜的主要优点是其高速成像能力和较低的光毒性，这使得它非常适合动态过程的实时观察，以及高分辨率下对切片进行快速观察及数据采集。此外，它还能提供较好的视野和较高的灵敏度，适用于弱信号的检测。不过，转盘共聚焦的分辨率略逊于点扫描共聚焦显微镜。

超分辨共聚焦显微镜（Super-Resolution Confocal Microscopy）

原理
超分辨共聚焦显微镜是指能够突破传统光学衍射极限的显微镜技术。通过多种技术手段，如STED、PALM、STORM等，可以实现纳米级别的分辨率。这些技术通过操纵激发态分子的行为或使用特定的荧光标签来实现超分辨率成像。

应用优缺点
超分辨共聚焦显微镜能够提供前所未有的高分辨率图像，适用于观察细胞内极为精细的结构，如细胞骨架、病毒粒子和蛋白质复合物等。这对于基础生物学研究和疾病机理的理解具有重要意义。然而，超分辨成像通常需要特殊的荧光标记，成像速度较慢，且设备成本较高。

如何选择共聚焦显微镜

点扫描共聚焦显微镜在分辨率上通常优于转盘共聚焦显微镜，但在成像速度和光毒性方面处于劣势。转盘共聚焦显微镜在快速获取共聚焦级别的组织切片图像数据和活细胞成像方面表现出色，但分辨率略逊一筹。超分辨共聚焦显微镜提供了最高的分辨率，但成像速度较慢，操作较复杂性。用户在选择合适的共聚焦显微镜时，需要根据具体的研究需求和样本特性来决定。