如何在慢病毒载体中正确使用两个启动子

如何在慢病毒载体中正确使用两个启动子

在基因研究中，将两个基因表达盒放在同一个慢病毒载体中是一种常见的载体设计方式，可以用于同时表达目的基因（GOI）和标记基因（如抗生素抗性基因或荧光报告基因）。然而，这种载体设计方式容易带来的一个问题是当两个表达盒使用了相同的启动子时，位于上游的基因会发生沉默。针对这一现象，我们已经在实验中有所证实。

在验证实验中，我们检测了具有两个表达盒的慢病毒载体稳转的细胞群，只有12%的细胞表达上游的报告基因，而97%的细胞表达下游基因（图A）。这两个表达盒均使用了同版本的CMV启动子（568 bp）。而且，我们发现调换两个报告基因的位置只能让表达上游表达盒的细胞比例增加到14%（图B）。如果我们使用长度更长的启动子，比如EF1α，则上游表达盒的表达效率更低——只有约1%的细胞有所表达上游基因（图C）。另一方面，如果针对两个表达盒的报告基因各自使用不同的启动子，比如EF1α和CMV，则这两个报告基因分别在96%和91%的转导细胞中发生了表达（图D）。

慢病毒转导293T细胞并进行嘌呤霉素药筛（A-D），MOI=10。转导后建立细胞稳转株，FACS测定两个荧光标记基因的表达。

这种沉默效应很可能与人类免疫缺陷1型病毒（HIV-1）的生命周期有关，而慢病毒正是源自此种病毒。每个HIV-1病毒颗粒包含两条单链RNA基因组，它们在宿主细胞中进行逆转录时会发生重组。因此，在含有相同启动子的慢病毒载体中，这些启动子之间的重组可能导致位于上游的开放阅读框丢失，从而导致上游的报告基因沉默。

为了探究两个启动子中相同序列的长度是否也会影响重组，我们使用了CBA和CMV启动子分别放入上游和下游表达盒进行了测试。这两个启动子均包含同样的一段279 bp序列。测试表明，这种设计方式可让占比32%的转导细胞表达上游基因。因此，两个启动子含有相同序列也会造成一定的重组。

更宽泛地说，我们的研究结果表明任何足够长度相同的序列都可能导致重组发生和表达沉默。例如，在使用EF1α和CMV启动子分别表达两个报告基因的载体中（图D），在每个表达盒的启动子和报告基因间插入一个249 bp的非编码填充序列，会使得上游报告基因的表达从96%的细胞占比减少到19%（图F）。该结果进一步证明了重复序列对于慢病毒载体表达效率的不良影响，因此在设计载体时应尽可能避免引入此类序列。

慢病毒转导293T细胞并进行嘌呤霉素药筛，MOI=10。转导后建立细胞稳转株，FACS测定两个荧光标记基因的表达。

此外，对于慢病毒载体的启动子选择，也应该考量所需要表达的转基因类型以及转导对象。以一个常见的双表达盒慢病毒载体为例，如果上游表达盒表达目的基因，下游表达盒表达标记基因，则上游可以使用一个强度较高的启动子，而下游使用强度适度的启动子，这是因为标记基因仅需满足基本的识别或者筛选需求即可。

对于不同类型的转导细胞，常用的CMV启动子更适合应用于肿瘤系细胞，而在干细胞中则会发生沉默。转导干细胞可使用另一个强启动子EF1α。如果是转导T细胞，CMV启动子的驱动效率也较低，建议使用EF1α、SFFV、MSCV这类启动子。值得留意的是，我们不建议在慢病毒中使用CAG启动子。经过我们观察，慢病毒载体使用CAG启动子会导致病毒包装时滴度变低，这可能是其高GC含量导致的。

多种类型启动子的等量慢病毒转导293T细胞

本文原文来自B站