单细胞流式双剑合璧｜解码肝转移性结直肠癌的细胞异质性

单细胞流式双剑合璧｜解码肝转移性结直肠癌的细胞异质性

结直肠癌（CRC）是世界上第三大最常见的恶性肿瘤，肝转移性结直肠癌也是CRC治疗中的重点和难点之一。2023年6月16日，广东省人民医院团队在《Science Advances》上发表了一篇重要研究，通过单细胞测序和空间转录组学技术，揭示了肝转移性结直肠癌的细胞异质性，为未来的癌症治疗提供了潜在的靶点。

背景介绍

结直肠癌（CRC）是世界上第三大最常见的恶性肿瘤[1]，肝转移性结直肠癌也是CRC治疗中的重点和难点之一，约21-26%的患者表现为同步转移性疾病[2]，其中14.5-17.5%的患者发展为肝转移[3,4]，绝大多数（80%-90%）的肝转移灶初始无法获得根治性切除。

在肝转移性结直肠癌的研究中，肿瘤微环境的改变及影响，对于理解关键机制和设计新的治疗策略至关重要。然而，免疫细胞如何在空间上协调大肠癌肝转移的进展，转移性细胞微环境是否与原发细胞不同，目前仍不清楚。

图1：结直肠癌的转移级联[5]

2023年6月16日，广东省人民医院团队发表在《Science Advances》上题为“Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer”的文章，该文使用了BD Rhapsody™ 完成了单细胞多组学数据分析，同时使用了mIHC和多色流式完成验证，提示TME内部的分子异质性，并为未来的癌症治疗提供潜在的靶点。

单细胞测序技术

BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析平台

BD Rhapsody™ Cartridge配套试剂盒（货号633731）

BD Rhapsody™ 反转录试剂盒（货号633773）
BD Rhapsody™ 全转录组扩增试剂盒（货号633801）
BD Rhapsody™ 微孔板（货号633733）
BD Rhapsody™ 多样本检测标签（SMK）（货号633781）
BD Abseq™ 寡核苷酸偶联抗体（货号940xxx）

流式技术

BD Aria III，BD Fortessa，FlowJo software

实验基本信息及Workflow

作者收集6例结直肠癌患者的外周血（PB）、邻近肝脏正常组织（LN）、肝脏转移组织（LM）、原发性结肠癌组织（CC）和邻近正常结直肠黏膜（CN）等5个类型的样本，处理成单细胞悬液，经由流式分选获得了41892个CD4-非免疫细胞与196473个CD4+免疫细胞，通过BD Rhapsody™ 单细胞平台进行捕获与建库，分别鉴定出23个非免疫细胞簇与41个免疫细胞簇。

图2：单细胞测序实验设计和分析工作流程的示意图概述

同时，作者又收集了6例患者的肿瘤组织样本，包括4例原发性结直肠癌患者（C1-C4）、2例肝转移性结直肠癌患者（L1-L2）。使用H&E染色、空间转录组、多色免疫组化及流式细胞术等方法，分别进行了肿瘤区域划分、基因表达分析、细胞分群及预后分析等研究。

图3：组织样本实验设计和分析工作流程示意图

研究思路

实验结论

1. CRC原发肿瘤和CRC肝转移瘤单细胞转录组揭示肿瘤细胞和免疫细胞之间的异质性

通过基于标记的注释，从非免疫细胞中识别出肿瘤细胞（EPCAM和SOX9）、成纤维细胞（COL1A1和COL1A2）和内皮细胞（PECAM1和CD34）；从免疫细胞中鉴定出来T细胞（CD3.pAbO）、自然杀伤（NK）细胞（CD56.pAbO）、B细胞/浆细胞（CD19.pAbO）、单核细胞/巨噬细胞（CD14.pAbO）、树突状细胞（DCs）（HLA.DRA）和肥大细胞（TPSAB1），在CRCLM的不同组织中发现了具有不同分布模式的多个细胞群。

2. CRC原发肿瘤和CRC衍生肝转移肿瘤的空间分布

通过苏木精和伊红（H&E）染色和每个样本的肿瘤区域(T)和肿瘤旁区（PT）。与肿瘤旁组织相比，肿瘤组织富含与细胞周期相关的通路，如G2-M检查点、E2F靶点和有丝分裂纺锤体。根据基因表达谱，将肿瘤组织和肿瘤旁组织分为不同的区域。考虑到每个点包含多个细胞，作者团队采用了基于签名的策略，整合了ST和scRNA-seq数据，以估计每个捕获点的不同细胞类型的比例。在ST组织中鉴定出B细胞、T细胞、NK细胞、浆细胞、髓系细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这些细胞簇的比例和分数在每个区域都是不同的。

3. 原发性肿瘤和肝转移性肿瘤之间的肿瘤细胞的转录组异质性

作者进行了亚聚类分析，发现肿瘤细胞的分化谱系不同。在CA8中鉴定出了簇状细胞的分化标记基因LRMP和TRPM5。CA9显示杯状细胞的标记物MUC2的高表达，肿瘤细胞群的异质性提示肿瘤细胞具有分化的潜力。LM中肿瘤细胞的种群多样性与CC相似，为了进一步研究不同肿瘤细胞簇的功能通路和转录程序，作者进行了基因集变异分析（GSVA）和转录因子（TF）分析，结果表明，CA2富含Wnt-β-连环蛋白信号通路，而在Wnt-β-连环蛋白信号通路中发挥重要作用的TF LEF1在CA2中表达上调。此外，CA2还表现出上调体细胞分裂途径的表达(图。S4D).同样，CA2对肠干细胞的标记物LGR5的表达水平最高。这些结果表明，CA2可能是TME中的干细胞亚群。

总的来说，聚类鉴定和特征分析证明了肿瘤细胞的功能多样性，而转移性肿瘤可以再现亲代肿瘤的细胞多样性。

4. TME重塑了髓系细胞的组成

作者鉴定了8个单核/巨噬细胞簇和3个常规树突状细胞（cDCs）簇，每个亚群都有不同的基因表达模式。轨迹分析显示，Mac_CXCL9和Mac_SPP1两个亚群均有终末分化，表明它们是肿瘤激活的亚群。LM中cDC_LAMP3亚群的百分比显著增加，表明肿瘤细胞对TIME的教育程度。

5. CXCL13+ T细胞在肝转移性肿瘤中富集

T细胞，特别是CD8+ T细胞和CD4+ T细胞，在适应性免疫应答中占主导地位。在T细胞中，鉴定出7簇CD8+ T细胞，5簇常规CD4+ T（cCD4）细胞和2簇treg。CD8+ T细胞和CD4+ T细胞都包含一个表达CXCL13的簇，这是CXCR5的趋化因子。与LN相比，LM中CD8_CXCL13细胞的百分比明显增加，但在CN、LN和PB中很少检测到。在结肠稳定状态下，约3-12%的CD4细胞CXCL13阳性，记为滤泡辅助T细胞（TFH）。综上所述，CD8_CXCL13细胞和CD4_CXCL13细胞在CRC的LM中均因其高增殖能力而表达上调。

6. CXCL13+ T细胞与结直肠癌患者预后良好相关

先前的研究表明，肿瘤反应性T细胞由于持续的肿瘤抗原刺激而表现出耗竭表型，而耗竭表型表明了它们的肿瘤反应性。轨迹分析显示，CD8_CXCL13细胞呈终末分化。此外，CXCL13+ T细胞亚群在TME中显示出显著的克隆扩增能力，进一步表明了它们的抗原经验特性。此外，CD8_CXCL13亚群也表达了高水平的效应分子，如GZMB，这表明该亚群可能保留了部分抗肿瘤功能。

7. 在结直肠癌的原发性和肝转移性肿瘤中存在不同的成纤维细胞亚群

成纤维细胞是TME中基质非免疫细胞的主要类型，不同的成纤维细胞亚群已经在广泛的肿瘤中被鉴定出来。因此，作者进一步对成纤维细胞进行了特征分析，以探讨其在结直肠癌原发性和肝转移性肿瘤中的异质性。在结直肠癌的TME中鉴定出8簇具有不同基因表达模式的成纤维细胞。与单细胞分析一致的是，F4_F3亚群只存在于CC中，而在LM中不存在，这一现象可能是由于LN中F4_F3的缺失和CN中F4_F3的存在引起的。ST分析也证实，CC中F4_F3亚群的浸润多于LM。在CN和CC中，F4_F3亚群紧密地围绕在上皮细胞周围，促进其与上皮细胞的相互作用。此外，CC中F4_F3浸润的增加可能导致预后更差。综上所述，在结直肠癌的原发性和肝转移性肿瘤中观察到不同的表型谱和高度可变的成纤维细胞频率，这表明在不同的癌症环境下，TMEs中存在细胞异质性。

8. 在原发肿瘤中富集的f3表达的成纤维细胞亚群分泌肿瘤前肿瘤因子，并与结直肠癌患者的不良预后相关

为了研究在CC和LM中富集的不同成纤维细胞对TME的重构，作者进一步分析了F2_MCAM和F4_F3的特征。F2_MCAM富含参与NOTCH信号通路的JAG1和NOTCH3。F4_F3富含C3和CXCL1，表明该亚群参与了补体和炎症反应通路。F4_F3还表达了高水平的MMP2和MMP3，这可能有助于细胞外基质的组织。此外，参与血管生成和肿瘤侵袭性的前肿瘤因子，如VEGFA、NRG1、HGF、GDF15、AREG和BMP2，在F4_F3中富集。F4_F3和肿瘤细胞之间的交互分析进一步揭示了他们通过NRG1和Erb-B2受体酪氨酸激酶3（ERBB3）通路，和ERBB3几乎富集在肿瘤细胞和可以与ERBB2形成异二聚体，促进肿瘤细胞增殖和抗结直肠癌患者。

9. 在LM的TME中表达MCAM的成纤维细胞通过Notch信号通路调节CD8_CXCL13细胞的生成

据报道，Notch信号通路可以调节CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫，然而，关于Notch信号通路是否可以调节CXCL13的表达，我们知之甚少。为了探索这种调节作用，我们使用JASPAR预测了RBPJ在CXCL13启动子上的结合位点。我们检测到几个潜在的结合位点，表明RBPJ可能作为一个TF影响CXCL13的表达。

10. ST组织中的细胞间相互作用网络

作者还研究了原发性肿瘤和肝转移性肿瘤中不同簇之间的细胞相互作用。结果表明，VEGFA-NRP1和VEGFA-NRP2配体-受体对在原发性和肝转移性肿瘤中均富集，发现在CRC原发肿瘤中富集的F3+成纤维细胞可以通过产生多种促肿瘤因子来调节其发育和/或迁移，包括NRG1，它与肿瘤细胞上表达的ERBB3相互作用，发挥其促肿瘤功能。然而，在LM中富集的MCAM+成纤维细胞可以通过Notch信号通路调节CD8_CXCL13细胞的生成，不同于CC中的肿瘤前体亚群F3+成纤维细胞，表明在不同的癌症环境下，基质细胞的细胞异质性。

总结

作者揭示了CRCLM的肿瘤和肿瘤旁组织的TME的细胞谱，揭示了成纤维细胞的不同谱系和功能，以及免疫细胞在不同癌症环境中的动态性质，这可用于进一步确定调节机制和潜在的治疗目标。

参考文献

[1] H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel, M. Laversanne, I. Soerjomataram, A. Jemal, F. Bray, Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71, 209–249 (2021).

[2] R. L. Siegel, K. D. Miller, A. Jemal, Cancer statistics, 2020. CACancer J. Clin. 70, 7–30 (2020).

[3] S. Manfredi, C. Lepage, C. Hatem, O. Coatmeur, J. Faivre, A.-M. Bouvier, Epidemiology and management of liver metastases from colorectal cancer. Ann. Surg. 244, 254–259 (2006).

[4] C. Hackl, P. Neumann, M. Gerken, M. Loss, M. Klinkhammer-Schalke, H. J. Schlitt, Treatment of colorectal liver metastases in Germany: A ten-year population-based analysis of 5772 cases of primary colorectal adenocarcinoma. BMC Cancer 14, 810 (2014).

[5] Dmello RS, To SQ, Chand AL. Therapeutic Targeting of the Tumour Microenvironment in Metastatic Colorectal Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 22(4):2067. (2021)