显微物镜的分辨率
显微物镜的分辨率
显微镜的分辨率是衡量显微镜性能的重要指标，它决定了显微镜能够分辨出的最小细节。本文将详细介绍显微物镜分辨率的计算方法、历史发展以及实际应用，帮助读者更好地理解显微镜的工作原理和使用方法。
一、标识
光学显微镜的分辨率定义为标本上两点之间的最短距离，观察者或相机系统仍可将其区分为单独的实体。所以有用之间的距离d去表示，也有用R去表示，以及δ标识，都是显微物镜的分辨率标识。
二、显微物镜的分辨率的计算
具有三个计算公式：
- 分辨率（r）=λ/（2NA）
- 分辨率（r）=0.61λ/ NA
- 分辨率（r）=1.22λ/（NA（obj）+ NA（cond））
其中r是分辨率（两个物体之间的最小可分辨距离），NA是显微镜数值孔径的总称，λ是成像波长，NA（obj）等于物镜数值孔径，NA（cond）是聚光镜数值孔径。注意，方程（1）和（2）由所述乘法因子，这是0.5方程不同（1）和0.61方程（2）。这些方程式基于许多因素（包括光学物理学家所做的各种理论计算）来说明物镜和聚光镜的行为，因此不应视为任何一项一般物理定律的绝对值。在某些情况下，例如共聚焦和荧光显微镜，分辨率实际上可能超过了这三个方程式中的任何一个所设定的极限。其他因素，例如较低的样品对比度和不适当的照明，可能会降低分辨率，并且往往会降低r的实际最大值（使用550纳米的中光谱波长，约为0.25 μm），并且数值孔径为在实践中无法实现1.35至1.40。下表（表1）提供了一个列表的分辨率（ř）和数值孔径（NA）值进行物镜放大和校正。
当显微镜完全对准并且物镜与次级聚光镜适当匹配时，我们可以将物镜的数值孔径代入方程式（1）和（2），将方程式（3）简化为方程式（2）。要注意的一个重要事实是，在任何这些方程式中，放大率都不是一个因素，因为只有数值孔径和照明光的波长才能确定样品的分辨率。
正如我们已经提到的（在等式中可以看到的），光的波长是显微镜分辨率的重要因素。较短的波长产生较高的分辨率（r的较低值），反之亦然。光学显微镜中最大的分辨力是通过近紫外光实现的，这是最短的有效成像波长。近紫外光之后是蓝色，然后是绿色，最后是红色，可以分辨出样品的细节。在大多数情况下，显微学家使用钨卤素灯泡产生的白光照亮样品。可见光谱的中心位于约550纳米，这是绿光的主要波长（我们的眼睛对绿光最敏感）。表1中就是用来计算分辨率值的波长。数值孔径值在这些方程式中也很重要，数值孔径越高，分辨率也越高。在固定数值孔径（0.95）下，光波长对分辨率的影响；
显微镜的分辨能力是光学系统的最重要特征，并且会影响区分特定样本精细细节的能力。如上所述，确定分辨率的主要因素是物镜的数值孔径，但是分辨率还取决于样本的类型，照明的相干性，像差校正的程度以及其他因素，例如光学系统中的对比度增强方法。显微镜或标本本身。归根结底，分辨率与显微镜的有用放大倍率和标本细节的感知极限直接相关。
三、一些理论历史
分辨率与数值孔径
数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜的孔径角（α）有关（NA=n × sin α）。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，要把显微镜聚光镜的NA也纳入考虑。在显微镜系统中，所有光学元件都正确对齐、具有相对较高的NA值并且相互协调工作，可以分辨出更多的图像细节。分辨率还与标本成像所用的光波长有关；波长越短，可分辨的细节越多，波长越长则分辨细节越少。
在处理分辨率时需要考虑三个数学概念：‘阿贝衍射极限’、‘艾里斑’和‘瑞利判据’。以下按时间顺序逐一介绍。
1、George Biddell Airy与‘艾里斑’（1835）
George Biddell Airy（1801-1892）是英国数学家和天文学家。1826年，25岁的他被任命为三一学院的数学教授，两年后，被任命为新剑桥天文台的天文学教授。1835年到1881年期间，他是“皇家天文学家”，月球和火星上各有一处以他的名字命名的陨石坑。
1835年，他在剑桥哲学学会学报上发表了一篇题为《有关圆孔径物镜的衍射》的论文。Airy在论文中以一个天文学家的视角描述了通过一个精良的望远镜观察到的恒星周围的光环或者射线的形状及亮度。尽管是从不同的科学领域发表的文章，但这些观察结果与其他光学系统，特别是显微镜存在着关联；
艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系统中由圆形孔径形成的聚焦的光点。如图图1所示，其呈现为中央亮点和周围是明暗相间的同心环（更准确地说，这是艾里图案Airy pattern）。
衍射图案由光的波长和光所通过的孔径大小决定。艾里斑的中心点含有大约84%的光强，其余16%分布于环绕该点的衍射图案中。当然，用显微镜进行观察时标本上会有许多光点，因此基于大量的艾里图案来考虑，而非如“艾里斑”描述的单个光点来考虑是更妥当的方式。
图1右所示的艾里图案三维表示又称为‘点扩散函数’。
2、Ernst Abbe与‘Abbe衍射极限’（1873）
Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德国数学家和物理学家。他与Carl Zeiss共同创立了“蔡司光学工作室”即现在的蔡司公司。除此之外，他还在1884年联合创办了Schott Glassworks。Abbe还是定义数值孔径这一术语的首位学者。1873年，Abbe发表了自己的理论和公式对显微镜的衍射极限进行了解释。Abbe发现，标本图像由许多重叠的、多强度且存在衍射极限的点（或艾里斑）所组成。
要提高分辨率（d=λ/2 NA），标本必须使用波长（λ）更短的光来进行观察，或者通过折射率相对高的成像介质来进行观察，又或者使用NA较高的光学组件来进行观察（或者将全部3种因素组合起来）。
但即便将所有这些因素都考虑在内，显微镜系统的极限依然受到限制，因为系统复杂性，波长低于400 nm的光在玻璃中的传播特征，以及整套显微镜需要达到较高的NA。理想光学显微镜的横向分辨率限制在200 nm左右，而轴向分辨率约为500 nm（有关分辨率极限示例，请参见下文）。
3、John William Strutt与‘瑞利判据’（1896）
第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英国物理学家，也是一位高产学者。他一生编写了多达466篇论文，包括430 篇科研论文。他的论文涉猎极广，各种主题都有，如鸟类飞行、心理研究、声学等等。1895年，他发现了氩并凭借这一发现于1904年获得诺贝尔奖。
Rayleigh以George Airy的理论为基础上并进一步延伸，于1896年创造了“瑞利判据”理论(Rayleigh Criterion)。瑞利判据（图2）在衍射极限系统当中定义了分辨率极限，换言之，就是何时能够将2个光点相互区分或分辨。
使用艾里斑理论，如果2个单独艾里斑的衍射图案不重叠，则就可以轻松区分、‘分辨’两者并认定满足瑞利判据（图2，左图）。而当艾里斑的中心直接重叠于另一个艾里斑的第一最小衍射图案时，则两者认定为‘刚好分辨’，同时依然可以区分为2个独立的光点（图2，中图）。如果艾里斑再继续相互接近，则两者无法满足瑞利判据，因此“无法被分辨”为2个不同的光点（或者标本图像中的单独细节；图2，右图）。
四、如何计算显微镜的分辨率
将以上全部理论都考虑在内就可以明显看出，在计算分辨率的理论极限时需要考虑很多因素。分辨率还取决于样本性质。我们来看一下使用阿贝衍射极限以及使用瑞利判据进行的分辨率计算。
首先应当要牢记：NA= n x sin α
式中n为成像介质的折射率，α是物镜孔径角的一半。物镜的最大孔径角大约为144º。该角度一半的正弦为0.95。如果使用油浸物镜且折射率为1.52，则物镜的最大NA为1.45。如果使用‘干式’（无浸没）物镜，则物镜最大NA为0.95（因为空气的折射率为1.0）。
横向（即XY）分辨率的阿贝衍射公式为：d= λ/2 NA
式中λ 是标本成像所用的光波长。如果使用514 nm的绿光及NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论）极限将达到177 nm。
轴向（即Z）分辨率的阿贝衍射公式为：d= 2 λ/NA2
同样的，如果我们假设通过波长514 nm的光来观察标本且物镜NA数值为1.45，则轴向分辨率为488 nm。
在阿贝衍射极限的基础上，瑞利判据稍稍得到了细化：R= 1.22 λ/NAobj+NAcond
式中λ为标本成像用的光波长。NAobj 为物镜NA。NAcond为聚光镜NA。‘1.22’是一个常系数。该数值根据Rayleigh的贝塞尔函数研究推导得出。这些主要用于对系统当中的问题，例如波的传递，进行计算。
将聚光镜的NA考虑在内，空气（折射率为1.0）通常是聚光镜和玻片之前的成像介质。假设聚光镜的孔径角为144º，则NAcond数值将等于0.95。
如果使用514 nm的绿光，油浸物镜的NA为1.45，聚光镜的NA为0.95，则分辨率的（理论）极限将达到261 nm。
如上所述，用于对标本成像的光波长越短，可以分辨的细节越多。因此如果使用400 nm的最短可见光波长，油浸物镜NA为1.45，聚光镜NA为0.95，则R等于203 nm。
要在显微镜系统当中达到（理论）分辨率的最大值，每个光学组件都应当具备最高可用的NA（把孔径角纳入考虑）。此外，观察标本所用的光波长越短则分辨率越高。最后，整个显微镜系统都应当准直对齐。
写给自己
对于显微物镜计算，在网站的数值上的计算为
分辨能力：R=λ/(2NA)
如10x物镜0.28NA，R=0.55/(2*0.28)=0.98≈1um
景深DOF：DOF=R/NA
按上面的10x物镜0.28NA，DOF=1um/0.28≈3.57um
这三个公式都是用来计算显微镜分辨率的，但它们适用于不同的情境和假设条件：
- 分辨率（r）= λ/(2NA)：
这个公式是由恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）提出的，用于计算横向（XY）分辨率的阿贝衍射公式。其中，λ代表光波长，NA代表显微镜的数值孔径。这个公式假设了物镜和聚光镜的数值孔径是匹配的，即NA(obj) = NA(cond)。在这种情况下，公式简化为0.61λ/NA，因为1.22（NA(obj) + NA(cond)） ≈ 2NA(obj)。
- 分辨率（r）= 0.61λ/NA：
这个公式是阿贝衍射极限的一个变体，它考虑了显微镜物镜的数值孔径（NA），并使用了一个经验系数0.61。这个系数是基于光学物理学家的各种理论计算得出的，用于电光源的显微镜，并且通常在物镜和聚光镜的数值孔径相匹配时使用。
- 分辨率（r）= 1.22λ/(NA(obj) + NA(cond))：
这个公式是基于瑞利判据的，它考虑了物镜（NA(obj)）和聚光镜（NA(cond)）的数值孔径。这个公式适用于计算系统中的问题，例如波传播，并且包含了一个常数1.22，这个常数是从瑞利关于贝塞尔函数的研究中得出的。
总结来说，第一个公式是最基本的阿贝衍射极限公式，第二个公式是考虑了电光源的衍射极限的经验公式，而第三个公式是考虑了物镜和聚光镜数值孔径的瑞利判据公式。在实际应用中，选择哪个公式取决于具体的显微镜配置和照明条件。
分辨率（r）=λ/（2NA）：这是阿贝衍射极限的公式，适用于横向（即XY）分辨率的计算。
分辨率（r）=0.61λ/ NA：这是瑞利判据的公式，它稍稍得到了细化，适用于计算显微镜的分辨率。
两个公式都是准确的，但它们描述的是不同的理论极限。阿贝衍射极限公式提供了一个较为保守的分辨率估计，而瑞利判据则提供了一个稍微宽松一些的估计。在实际应用中，选择哪个公式取决于具体的应用场景和理论背景。例如，在显微镜领域，瑞利判据（0.61λ/NA）更为常用，因为它提供了一个较为实用的分辨率估计。