甲基化敏感内切酶在甲基化分析中的应用

甲基化敏感内切酶在甲基化分析中的应用

DNA甲基化是表观遗传学中研究最深入的修饰方式之一，它在基因表达调控中发挥着重要作用。本文将详细介绍DNA甲基化的概念、调控作用以及各种分析方法的演变和具体步骤。

DNA甲基化的概念

表观遗传学是指在基因组的核苷酸序列不发生改变的情况下，生物个体表型却发生了可遗传性变化的现象。DNA 甲基化是目前研究最深入的表观遗传修饰，简言之，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基的化学修饰过程，在哺乳动物中，主要生成为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。

DNA甲基化的调控作用

在原核生物中，5mC 的主要功能是建立限制性修饰体系，从而识别和保护细菌 DNA 免于外部 DNA 的干扰。在真核生物中，DNA 甲基化的功能则更为复杂，主要是 DNA 甲基化在真核生物中具有表达调控的功能。

在哺乳动物细胞中，约 70%的 5mC 修饰发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)密集的核酸序列上 即CpG岛中，而管家基因的启动子通常在 CpG 岛序列内。这使得 DNA 甲基化修饰可以阻止转录因子与 DNA 上的调控位点相结合，并通过募集转录抑制因子来抑制转录，广泛的高甲基化修饰可以完全沉默靶基因的表达， 反之低水平的甲基化修饰会使得基因的转录激活，靶基因的表达增加。

在植物中，DNA 甲基化的改变通常会引起植物形态的缺陷， 如叶片形状、根系结构的改变等。

图1-DNA甲基化修饰对转录的影响

DNA甲基化分析方法的演变

液相色谱法

基本原理是DNA样品被DNA酶、碱性磷酸酶和核酸外切酶水解，色谱分离后，通过计算基因组DNA甲基化碱基占比，获得整体甲基化水平。但无法获得关于甲基化发生的位置信息，目前已经不广泛使用。

二维电泳

限制性内切酶切割某些富含CpG位点的基因组区域，通过二维凝胶电泳分离酶消化后片段。该方法主要应用于位点、区域或器官靶向研究，评估基因组水平的甲基化状态，该方法分辨率相对较低，因而基于二维电泳的分析技术正逐渐被取代。

微阵列杂交

微阵列杂交技术极大促进了DNA甲基化组学分析，其分辨率高于二维电泳技术。在甲基化测序技术中，亚硫酸盐转化法，甲基化敏感的限制性核酸内切酶消化和针对甲基化片段的免疫沉淀3种技术在DNA样品的预处理中采取了不同的方式，但后续步骤均应用微阵列杂交技术。微阵列技术的出现促进了我们在更广泛的层面上对 DNA 甲基化模式的理解。尽管增加的样本量可实现相对更经济和全面的 DNA 图谱，但测序技术在准确性和深度上的优势使之逐渐取代芯片平台已经成为趋势。

高通量测序技术

第一代基于测序的甲基化分析适用于在单核苷酸分辨率下分析 DNA 甲基化。在 1990 年代，基于亚硫酸氢盐转化的测序（DNA 甲基化分析的“金标准”）的发展促进了基于测序的甲基化分析的突破。二代测序平台在基于NGS 技术的甲基化分析中，由于长 DNA片段的分割，读取长度缩短，较长的甲基化信息模式丢失，需要大规模生物信息学计算。第三代测序能够凭借来自其他核苷酸碱基的 5mC 的独特信号实时检测长读长单分子的 DNA 甲基化。因此，长读长测序促进了高通量甲基化组分析的下一次革命。

图2-DNA甲基化分析方法的演变

全基因组DNA甲基化分析的常用方法

样本前处理

通过限制性内切酶消化或超声处理对基因组DNA进行片段化。

中间步骤

基因组DNA可以进行MBD富集、抗体富集、亚硫酸氢盐转化或TET氧化。

• MBD富集：利用能够结合甲基化DNA的蛋白对甲基化的DNA进行免疫沉淀。该技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，不能从单个碱基水平分析甲基化。
• 抗体富集：一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术同样可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。
• 亚硫酸氢盐转化：通过化学脱氨的过程将未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。
• TET氧化：将甲基化的5mC进一步催化成5caC。

甲基化检测

通过微阵列或高通量测序平台进行分析。

图3-全基因组DNA甲基化分析的常用方法原理示意图

全基因组DNA甲基化分析常用方法步骤

对全基因组DNA甲基化分析常用方法的主要步骤进行整理如下图，其中在DNA样品前处理步骤中使用限制性内切酶消化的方式是MRE-Seq（甲基化敏感性的限制性内切酶测序）和RRBS（亚硫酸盐测序）。

图4-DNA甲基化检测技术主要步骤

亚硫酸盐测序 (RRBS)

步骤

1. 基因组DNA首先被特定的限制性内切酶消化，产生片段 (通常在50-300bp的范围内)，末端带有CpG。
2. 由酶消化产生的粘性双链 DNA 3‘ 末端被修复，加A尾 (A-Tailing)。
3. 加接头。(加接头的作用：甲基化序列接头可以防止亚硫酸氢盐转化过程中胞嘧啶的脱氨)
4. 凝胶电泳，选择所需的片段大小进行纯化。
5. 亚硫酸盐处理选定的 DNA 片段，以将未甲基化的胞嘧啶脱氨到尿嘧啶中。
6. PCR扩增和纯化后，DNA产物被适配到测序平台上进行测序。

方法优点

高灵敏度：可以靶向难以用常规亚硫酸盐测序，和许多肿瘤类型重复序列分析的甲基化区域，非常适合发育生物学中的甲基化状态分析。

方法缺点

RRBS中使用的限制性内切酶不一定能覆盖所有CpG富集区域，可能会遗漏一些位点信息。

图5-RRBS主要步骤示意图

甲基化敏感性的限制性内切酶测序 (MRE-Seq)

MRE-seq允许等位基因特异性DNA甲基化扫描，并且能够覆盖比传统阵列杂交更广泛的基因组区域 。

步骤

1. MRE-seq通过多种甲基化敏感的限制酶（如 HpaII (CˇCGG)、HinP1I (GˇCGC) 和AciI (CˇCGC) ，等）对基因组进行扫描，切割未被甲基化的CpG位点。
2. 合并产物后分选片段，进行末端修复反应和单核苷酸接头连接，PCR扩增和纯化后上机测序。
3. 测序结果与参考基因组比对后，可以将未甲基化的CpG位点可进一步转化为甲基化水平。

方法优点

MRE-seq是一种单CpG分辨率的DNA甲基化分析方法，适合低CpG密度区域。

方法缺点

但MRE-seq依赖不同限制酶，基因组中酶切位点的分布限制了其覆盖范围，同时一些不完全酶切可能会导致一定的假阳性结果。

图6-MRE-Seq主要步骤示意图

HELP-Seq 连接介导PCR富集HpaII微小片段技术 (HELP)

HELP (HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR),采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性内切酶MspI处理，来对基因组内及基因组间的甲基化位点进行比较，进而实现甲基化测序。

步骤

1. HpaII限制性内切酶消化。
2. 寡核苷酸连接，该寡核苷酸对与限制性内切酶产生的末端内聚物产生末端内聚。这可作为 PCR 引物的模板，用于进行连接介导的 PCR （LM-PCR）。产物大小为 200 至 2000 bp可以使用各种平台分析扩增产物。
3. 共杂交到定制的基因组微阵列中。
4. 亚硫酸盐测序。

方法优点

HELP检测具有稳定性、定量性和准确性。HELP检测可用于任何基因组微阵列，也可用于检测对靶序列胞嘧啶甲基化敏感性不同的限制性内切酶异裂异构体的任何组合。

方法缺点

仅查询HpaII位点，并且在应用于阵列时分辨率相对较低。为了增加评估的CpG数量，MRE和基于阵列的检测纳入了多个平行的MRE酶解。

图7-HELP主要步骤示意图

宝锐甲基化敏感内切酶

产品：HinP1 I, Hha I, Aci I, Hpa II, BssH II, BsrF I, BspE I.

产品特点

特异性：酶切识别特异性强，产物清晰。

高效率：验证酶切效率高。达到或优于进口产品。

高保真：过夜酶切，星号活性极低。

推荐产品

参考文献

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