病毒的分离、培养和鉴定

病毒的分离、培养和鉴定

学习目标

• 讨论为什么最初将病毒描述为可过滤剂
• 描述病毒的培养以及标本的收集和处理
• 比较用于培养病毒的体内和体外技术

在本章开头，我们描述了如何使用孔隙小到允许病毒通过的钱伯兰瓷过滤器来发现 TMV。 如今，陶瓷过滤器已被膜过滤器和其他用于分离和识别病毒的设备所取代。

病毒隔离

与细菌不同，细菌中有许多可以在人工营养培养基上生长，而病毒需要活宿主细胞才能复制。 可以培养和培养受感染的宿主细胞（真核生物或原核细胞），然后收获生长培养基作为病毒来源。 液体介质中的病毒体可以通过离心或过滤与宿主细胞分离。 过滤器可以物理去除溶液中存在的任何大于病毒体的东西；然后可以在滤液中收集病毒（图1）。

图1：膜过滤器可用于从溶液中去除细胞或病毒。 (a) 这张扫描电子显微照片显示了在膜过滤器表面捕获的棒状细菌细胞。 注意膜孔和细菌的比较大小存在差异。 病毒将通过此过滤器。 (b) 过滤器中孔隙的大小决定了过滤器表面捕获的物质（动物 [红色] 和细菌 [蓝色]）以及从流过的液体中去除的物质。 请注意，病毒（绿色）会通过更精细的过滤器。 （来源 a：美国能源部对工作的修改）

培养病毒

病毒可以在体内（在整个活生物体、植物或动物内）或体外（在活生物体外，在人工环境中的细胞中生长，例如试管、细胞培养瓶或琼脂板）。 噬菌体可以在培养皿或扁平（水平）烧瓶中生长在 0.7% 软琼脂中的致密细菌层（也称为细菌草坪）的情况下生长（图2a）。 琼脂浓度从通常用于培养细菌的1.5％有所降低。 柔软的 0.7% 琼脂使噬菌体能够轻松地通过培养基扩散。 对于裂解噬菌体，当检测到称为斑块的空白区域时，可以很容易地观察到细菌宿主的裂解（图2b）。 当噬菌体杀死细菌时，在浑浊的细菌草坪上观察到许多斑块。

图2：(a) 像这样的烧瓶可以用来培养人或动物细胞进行病毒培养。 (b) 这些板块含有生长在大肠杆菌草坪上的噬菌体 T4。 在宿主细菌细胞被裂解的地方，可以看到透明的斑块。 左侧板上的病毒滴度增加。 （来源 a：修改美国国立卫生研究院的工作；来源 b：美国微生物学会对著作的修改）

动物病毒需要宿主动物内的细胞或源自动物的组织培养细胞。 动物病毒培养对于 1) 鉴定和诊断临床标本中的致病病毒，2) 疫苗的生产以及 3) 基础研究很重要。 体内宿主来源可以是胚胎鸟蛋（例如鸡、火鸡）中的发育胚胎或整只动物。 例如，为年度流感疫苗接种计划生产的大多数流感疫苗都是在母鸡卵中培养的。

胚胎或宿主动物充当病毒复制的孵化器（图3）。 在胚胎或宿主动物内的位置很重要。 许多病毒具有组织向性，因此必须将其引入特定的生长部位。 在胚胎内，靶位点包括羊膜腔、绒毛膜尿囊或卵黄囊。 病毒感染可能破坏组织膜，产生称为痘的病变；破坏胚胎发育；或导致胚胎死亡。

图3：（a）鸡蛋中的细胞用于培养不同类型的病毒。 (b) 病毒可以在卵内的不同部位复制，包括绒毛膜尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊。 （来源 a：“Chung Hoang” /YouTube 对作品的修改）

对于体外研究，可以使用各种类型的细胞来支持病毒的生长。 原代细胞培养物是用动物器官或组织新鲜制成的。 通过机械刮擦或切碎从组织中提取细胞以释放细胞，或者通过使用胰蛋白酶或胶原酶的酶法分解组织并将单个细胞释放到悬浮液中。 由于对锚固依赖性的要求，原代细胞培养需要在培养皿或组织培养瓶中使用液体培养基，这样细胞就具有固体表面，例如玻璃或塑料，用于附着和生长。 初级文化的寿命通常有限。 当原代培养物中的细胞经历有丝分裂并产生足够密度的细胞时，细胞就会与其他细胞接触。 当这种细胞间的接触发生时，会触发有丝分裂停止。 这称为接触抑制，它可以防止细胞的密度变得过高。 为了防止接触抑制，必须将来自原代细胞培养物的细胞转移到另一个装有新鲜生长培养基的容器中。 这称为二次细胞培养。 必须定期通过倒掉一些细胞并添加新鲜培养基来降低细胞密度，为维持细胞生长提供空间和营养。 与原代细胞培养不同的是，通常源自转化细胞或肿瘤的连续细胞系通常能够进行多次亚培养，甚至无限期生长（在这种情况下，它们被称为不朽）。 连续细胞系可能不表现出锚固依赖性（它们将在悬浮状态下生长），并且可能已经失去了接触抑制作用。 因此，连续的细胞系可以成堆或肿块生长，类似于小肿瘤的生长（图4）。

图4：培养用细胞是通过将其与组织基质分离来制备的。 (a) 初级细胞培养物附着在培养容器表面生长。 一旦细胞变得过于密集并开始相互接触，接触抑制就会减缓细胞的生长。 在这一点上，只有培养次要文化才能维持增长。 (b) 连续细胞培养不受接触抑制的影响。 无论细胞密度如何，它们都会继续生长。 （来源 “显微照片”：疾病控制与预防中心对工作的修改）

检测病毒

无论采用何种培养方法，一旦病毒被引入整个宿主生物、胚胎或组织培养细胞，就可以从受感染的宿主、胚胎或细胞系中制备样本，以便在明场、电子或荧光显微镜下进行进一步分析。 细胞病变效应（CPE）是病毒感染引起的明显可观察到的细胞异常。 CPE 可能包括失去对容器表面的粘附力、细胞形状从扁平变为圆形、细胞核收缩、细胞质中的液泡、细胞质膜融合和多核合胞的形成、细胞核或细胞质中的包涵体以及细胞完全裂解（见图5）。 进一步的病理变化包括病毒破坏宿主基因组和将正常细胞转化为转化细胞，这些细胞是与癌症和肉瘤相关的细胞类型。 CPE 的类型或严重性取决于所涉及的病毒类型。 图中列出了针对特定病毒的 CPE。

图5：（来源 “显微照片”：美国微生物学会对著作的修改）

血凝试验

血清学检测用于检测患者血清中是否存在某些类型的病毒。 血清是血浆中的稻草色液体部分，从中去除了凝血因子。 血清可用于称为血凝测定的直接检测，以检测患者样本中的特定类型的病毒。 血凝是红细胞（红细胞）的凝集（结块）。 许多病毒会产生称为血凝素的表面蛋白质或尖峰，它们可以与红细胞膜上的受体结合并导致细胞凝集。 无需使用显微镜即可观察到血凝作用，但是这种方法并不总是区分传染性和非传染性病毒颗粒，因为两者都可以凝集红细胞。

要使用血凝剂识别特定的致病病毒，我们必须使用间接方法。 称为抗体的蛋白质由患者的免疫系统生成，用于对抗特定病毒，可用于与特定类型病毒独特相关的血凝素等成分结合。 抗体与病毒上发现的血凝素的结合随后会阻止红细胞直接与病毒相互作用。 因此，当将红细胞添加到抗体包衣病毒中时，不会出现凝集现象；凝集受到抑制。 我们将这些类型的间接检测称为病毒特异性抗体血凝抑制（HAI）测定。 HAI 可用于检测是否存在针对许多类型病毒的特异性抗体，这些抗体可能在患者感染数月或数年后引起或已经引起感染（见图7）。凝集测定中对该测定进行了更详细的描述。

图7：该图显示了血凝测试的可能结果。 A 行：红细胞不会结合在一起，会沉入井板的底部；这在井中变成了一个红点。 B 行：许多病毒含有导致红细胞凝集的血凝素；由此产生的血凝形成晶格结构，导致整个井中呈红色。 C 行：将病毒特异性抗体、病毒和红细胞添加到孔板中。 病毒特异性抗体抑制凝集，可以看作是井底的红点。 （来源：疾病控制与预防中心对工作的修改）

核酸扩增试验

核酸扩增试验 (NAAT) 在分子生物学中用于检测患者样本中独特的病毒核酸序列。 聚合酶链反应（PCR）是一种NAAT，用于检测患者组织或体液样本中是否存在病毒 DNA。 聚合酶链反应是一种扩增（即合成许多拷贝）感兴趣的病毒 DNA 片段的技术。 使用聚合酶链反应，称为引物的短核苷酸序列与病毒 DNA 的特定序列结合，从而能够鉴定病毒。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种用于检测 RNA 病毒存在的 NAAT。 逆转录聚合酶链反应与聚合酶链反应的不同之处在于，逆转录酶 (RT) 酶用于从样本中的少量病毒 RNA 中制成 cDNA。 然后可以通过聚合酶链反应扩增cDNA。 聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应均用于检测和确认患者标本中是否存在病毒核酸。

酶免疫测定

酶免疫测定（EIA）依赖于抗体检测和附着在称为抗原的特定生物分子上的能力。 检测抗体在可能是复杂的生物分子混合物中以高度的特异性附着在靶抗原上。 这种类型的测定中还包括附着在检测抗体上的无色酶。 该酶充当检测抗体上的标签，可以与无色底物相互作用，从而产生彩色的最终产物。 EIA 通常依靠多层抗体来捕获抗原并与之发生反应，所有这些抗原都附着在膜过滤器上（见图8）。 病毒抗原的环境影响评估通常用作初步筛查测试。 如果结果为阳性，则需要进行更高灵敏度的检测，例如免疫印迹或NAAT。 环境影响评估和 ELISA 中对环境影响评估进行了更详细的讨论。

图8：与快速的非处方妊娠试验类似，病毒抗原的环境影响评估需要在膜过滤器上涂几滴稀释的患者血清或血浆。 膜过滤器之前已经过修改，并嵌入了针对病毒抗原和内部控制的抗体。 抗体偶联物被添加到过滤器中，靶向抗体附着在抗原上（如果检测结果呈阳性）。 多余的共轭物会从滤波器中冲走。 添加底物以激活酶介导的反应，从而揭示阳性测试的颜色变化。 （来源：“Cavitri” /Wikimedia Commons 对作品的修改）

摘要

• 病毒培养需要存在某种形式的宿主细胞（全生物体、胚胎或细胞培养）。
• 病毒可以通过过滤从样本中分离出来。
• 病毒滤液是释放的病毒体的丰富来源。
• 噬菌体是通过细菌草坪上存在透明斑块来检测的。
• 动植物病毒是通过细胞病变效应、分子技术（PCR、RT-PCR）、酶免疫测定和血清学检测（血凝试验、血凝抑制试验）来检测的。