DNS法测定还原糖含量：原理、步骤与注意事项详解
DNS法测定还原糖含量：原理、步骤与注意事项详解
DNS法（二硝基水杨酸法）是一种常用的化学分析方法，用于测定样品中的还原糖含量。本文将详细介绍DNS法的原理、实验步骤、注意事项及相关问题解答，帮助读者全面了解这一实验方法。
一、原理
DNS法即二硝基水杨酸法，其原理是在碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸。该产物在煮沸条件下呈现棕红色，且在一定浓度范围内，颜色深浅与还原糖含量呈比例关系。通过比色法，可以定量测定样品中的还原糖含量。
二、试剂制备
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。
DNS试剂：称取6.3g 3,5-二硝基水杨酸用400mL蒸馏水溶解，逐步加入氢氧化钠，再加入四水合酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠，温水浴，不断搅拌，直至溶液清澈透明，用蒸馏水定容至1000mL，保存在棕色瓶中，静置5-7天后使用，贮存期为6个月。
三、标准曲线绘制
试管编号 | 葡萄糖标准液（1mg/ml）（ml） | 蒸馏水（ml） | DNS试剂（ml） | 吸光度 |
|---|---|---|---|---|
1 | 2.0 | 2.0 | ||
2 | 0.2 | 1.8 | 2.0 | 0.239 |
3 | 0.4 | 1.6 | 2.0 | 0.462 |
4 | 0.6 | 1.4 | 2.0 | 0.685 |
5 | 0.8 | 1.4 | 2.0 | 0.885 |
6 | 1.0 | 1.2 | 2.0 | 1.178 |
分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15 ml试管中，用蒸馏水补足至1.0ml，然后每管分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。
四、样品测定
将发酵液稀释一定倍数后，取3只比色管标号1、2、3，各加入稀释后的发酵液0.5 ml，再分别加入DNS试剂0.5 ml混匀，沸水浴5min，冷却后加入4 ml蒸馏水混匀，在540 nm下测吸光度。
样品液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度，从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数，求出样品中糖含量。
五、注意事项
- DNS配制后需放置一个星期以上才可以用，与物质完全反应需时有关，但最好不要放置太长时间，配置时根据样品量决定用量，一般配两三个月够用即可，每隔一段时间需重新做标准曲线。
加热煮沸时最好用电磁炉烧水，沸腾后就把试管放进去，尽量保持试管浸入深度一致，也可买个具塞试管或者在试管口放置个玻璃球，尽量减少蒸发。
DNS试剂在棕色瓶中4℃保存，放很久都没有问题。
六、相关问题与解答
- 为什么DNS法适合用于多糖水解产生的多种还原糖体系的测定：因为DNS法显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，所以适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。
- DNS试剂放置时间对测定结果的影响：DNS试剂配制后必须放置一个星期以上才可以用，这是因为其与物质完全反应需要一定时间，若放置时间过短，可能导致反应不完全，影响测定结果的准确性，放置时间也不宜过长，一般不超过6个月为宜，否则试剂可能会变质或失效。