冰冻切片免疫组化（IHC-Fr）技术详解

冰冻切片免疫组化（IHC-Fr）技术详解

冰冻切片免疫组化（IHC-Fr）是一种基于抗原表位与抗体相互作用的定位监测技术，广泛应用于医学研究和临床诊断中。本文将详细介绍IHC-Fr技术的原理、实验步骤、优势与局限性，并通过具体案例分析抗体的应用。

IHC-Fr
免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）是基于抗原表位与抗体相互作用的定位监测技术。IHC使用组织切片，ICC使用培养的细胞，最终均需借助分子标记物（荧光或染料）实现阳性染色。其基本流程为：固定样本以维持细胞完整性，使用封闭试剂孵育样本以覆盖非特异性结合位点，随后进行一抗和二抗孵育，最终在显微镜下观察信号。
IHC-P是指石蜡切片免疫组化，IHC-Fr是指冰冻切片免疫组化，IF是指免疫荧光。R&D和Novus的抗体中，ICC/IF表示细胞免疫荧光，IHC表示组织免疫荧光或免疫组化。对于R&D的产品，IHC等同于IF，没有冰冻和石蜡之分；而对于Novus的产品，如果说明书仅标注IHC而无具体IHC-P或IHC-Fr标记，则表示该抗体可用于IHC-P和IHC-Fr应用，若有具体IHC-P或IHC-Fr标记，则以具体说明为准。

IHC-Fr技术详解

原理与应用
IHC-Fr，即冰冻切片免疫组化，是一种利用冰冻切片进行抗原定位的技术。与石蜡切片相比，冰冻切片能够更好地保留组织的抗原性和细胞结构，尤其适用于一些对热敏感或易降解的抗原检测。IHC-Fr广泛应用于医学研究和临床诊断中，可用于检测组织中的蛋白质、肽类等抗原物质，帮助研究人员了解疾病的发生机制和病理变化。

实验步骤

1. 样本准备：选取新鲜组织样本，迅速放入液氮或干冰中速冻，然后储存于-80℃冰箱中备用。速冻过程需迅速且均匀，以避免冰晶形成对组织结构造成破坏。

2. 切片：使用冷冻切片机将组织块切成5-10μm厚的切片。切片过程中需保持切片机和样本的低温状态，以防止抗原降解。

3. 固定：将切片置于固定液（如冷的丙酮或甲醇）中固定5-10分钟。固定液的选择需根据具体抗原的性质和实验要求进行调整。

4. 封闭：用封闭液（如正常血清或BSA）孵育切片，以减少非特异性结合。封闭时间一般为30分钟，温度为室温或37℃。

5. 抗体孵育：加入一抗（如针对目标抗原的特异性抗体），在4℃孵育过夜或室温孵育1-2小时。一抗的选择需根据目标抗原的特性和实验需求进行筛选。

6. 洗涤：用PBS或TBS缓冲液洗涤切片，去除未结合的一抗。

7. 二抗孵育：加入与一抗对应的二抗（如HRP或荧光标记的二抗），在室温下孵育30分钟至1小时。

8. 洗涤：再次用PBS或TBS缓冲液洗涤切片，去除未结合的二抗。

9. 显色与观察：对于HRP标记的二抗，可加入DAB底物进行显色反应；对于荧光标记的二抗，可直接在荧光显微镜下观察。显色反应需在适宜的条件下进行，以确保信号的清晰和稳定。

10. 封片与保存：用封片剂封片后，可在光学显微镜或荧光显微镜下观察并拍照记录结果。封片后的切片需妥善保存，避免光照和潮湿环境。

优势与局限
IHC-Fr具有以下优势：

• 抗原保留：冰冻切片能够较好地保留组织的抗原性和细胞结构，尤其适用于对热敏感或易降解的抗原检测。

• 操作简便：相较于石蜡切片，冰冻切片的制备过程更为简便快捷，适合快速诊断和研究。

• 适用范围广：IHC-Fr可应用于多种组织类型和抗原检测，具有广泛的应用前景。

然而，IHC-Fr也存在一些局限性：

• 切片质量：冰冻切片的厚度较难控制，且易出现裂纹和变形，影响观察结果。

• 背景染色：由于冰冻切片的非特异性结合较高，可能导致背景染色增加，影响结果的准确性。

• 保存条件：冰冻切片需在低温条件下保存和运输，对实验条件要求较高。

案例分析
以Novus产品为例，货号NBP1-51602的AKT1抗体，其IHC和IHC-P应用仅限于石蜡组织切片的免疫组化和免疫荧光。该抗体在IHC-P应用中表现出良好的稳定性和可重复性，适用于多种石蜡包埋组织样本的检测。其推荐稀释度为1:500 - 1:2000，具体最佳稀释度需由各实验室根据具体应用确定。该抗体在石蜡切片免疫组化中能够有效检测人AKT1蛋白的表达，且在多个实验中表现出良好的特异性和敏感性。

总结
IHC-Fr作为一种重要的免疫组化技术，具有广泛的应用前景和独特的优势。在实际应用中，需根据具体实验需求和样本特性选择合适的抗体和实验条件，以获得准确可靠的检测结果。同时，不同厂家对于相同简称的实际应用指代可能存在显著差异，选择抗体时需仔细了解厂家对于简称的实际应用指代，以避免购买错误的抗体。当需要多种应用的抗体时，R&D品牌是一个值得考虑的选择，因为其IHC质保涵盖了细胞和组织的免疫组化和免疫荧光应用。此外，专业的抗体推荐服务可以提供帮助，只需提供靶标、种属和应用信息，即可获得最优抗体推荐。

名称 货号 规格
IHC HAB2192 EA
Anti-Rabbit and Mouse HRP&DAB IHC detection kit S0C1001-5ml(for50slides) 5ml (for 50 slides)
Anti-Rabbit HRP-DAB IHC detection kit S0C2031-5ml-for50slides 5ml(for50slides)
SignalStain ® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) 18653S 15ml