小鼠脾脏CD8+T细胞提取分离实验步骤
小鼠脾脏CD8+T细胞提取分离实验步骤
CD8+T细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有直接杀伤靶细胞和产生多种细胞因子的功能。本文详细介绍了从C57小鼠脾脏中提取CD8+T细胞的实验步骤，包括材料准备、操作流程、流式鉴定方法以及该细胞在肿瘤免疫治疗中的应用前景。
背景简介
CD8+T细胞属于在其表面表达CD8的T细胞亚群之一，也被称为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)，通过与抗原提呈细胞相互作用后活化增殖并发挥其杀伤功能。
作为T淋巴细胞的主要组分之一，CD8+T细胞可通过与靶细胞直接接触，并通过分泌颗粒酶和穿孔素杀伤肿瘤细胞，同时CD8+T细胞也可以释放细胞因子如IFN-γ和TNF-α等，从而进一步调节宿主的免疫反应。
基本信息
细胞名称：小鼠脾脏CD8+T细胞
分离方法：磁珠分选
组织来源：C57小鼠脾脏
细胞形态：圆形、淋巴母细胞样
生长特性：悬浮生长
细胞形态
小鼠CD8+T细胞是一种悬浮细胞，细胞形态呈圆形，细胞可激活传代。
小鼠脾脏CD8+T细胞特点
1.细胞杀伤
通过CD8+T细胞的受体识别靶细胞并特异性结合，然后释放颗粒酶，穿孔素等，破坏靶细胞，直接杀伤靶细胞;
2.产生细胞因子
CD8+T细胞也可产生多种细胞因子，除了IFN- γ和TNF-α外，CD8+T细胞还可以分泌多种白细胞介素如IL-4、IL-5、IL-9等调节宿主的免疫反应;
3.具有多个亚型
CD8+T细胞也可细分为多个亚型包括Tc1、Tc2、Tc9、Tc17和Tc22，在机体中发挥不同功能;
4.免疫记忆功能
当机体受到病原体的二次侵入时，记忆CD8+T细胞能够介导更加快速、强烈、有效的免疫应答。
小鼠脾脏CD8+T细胞提取分离实验步骤
材料准备
工具：4-6周C57小鼠、小鼠CD8+T细胞分选试剂盒 、红细胞裂解液、眼科镊、眼科剪、细胞筛网、PBS缓冲液、小鼠脾脏CD8+T细胞专用培养基。
提前开启紫外线照射超净台30min：将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 min。HBSS缓冲液缓冲液预冷，紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 min以上。
培养瓶：准备25cm2的培养瓶。
操作步骤
1.处死小鼠，无菌取出脾脏，使用PBS清洗干净脾脏，在70 μm 细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的PBS冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于 50 mL 离心管中，500 g，离心5 min。
2.离心结束，弃上清，加入5 mL红细胞裂解液(ACK)，室温裂解5 min，再加入20 mL PBS，500 g， 离心5 min。
3.将脾细胞重悬于PBS，细胞悬液用70 μm 细胞筛网过滤后，计数，调整细胞密度为1×108 cells/mL。
4.按照每100 μL 细胞悬液(1×107个细胞)对应2 μL Biotin-Antibody Mix加入无菌流式管底部，混匀后 4°C 孵育10 min。
5.孵育完成后，在流式管中加入 20 μL streptavidin磁珠(1×107个细胞)(使用前涡旋振荡重悬磁珠，确保磁珠完全重悬)，混匀后4°C 孵育10 min。
- 孵育完成后，在流式管中加入2.5 mL分选buffer，用移液器上下混合吹打5次混匀(避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀)。
7.将含有细胞的流式管置于磁力架上，静置5 min。将细胞悬液轻柔倒入一个无菌离心管中(倾倒过程中流式管不要脱离磁力架)，此细胞悬液中即包含 纯化的小鼠CD8+T细胞，500 g，离心5 min。离心后弃上清，收集细胞， 将细胞重悬于培养基中，即可用于后续扩增。
小鼠脾脏CD8+T细胞流式鉴定
CD8是CD8+T细胞重要的标记物,也是识别CD8+T细胞最可靠的标志。
小鼠脾脏CD8+T细胞研究应用
研究
CD8+T细胞是人体免疫系统的重要组成部分，通过识别和攻击被感染的细胞或异常细胞，其功能的发挥主要通过与靶细胞接触杀伤靶细胞，在宿主肿瘤免疫以及抵御病原微生物侵害方面发挥着关键作用。
实验研究：通过分离培养CD8+T细胞可更便于在体外观察CD8+T细胞与多种免疫细胞共同协作引发宿主正常细胞和癌细胞损伤的机制，从而通过药物干预的方法激活或抑制CD8+T细胞活力从而达到治疗患者的目的。
应用
TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)疗法
从患者体内提取肿瘤组织中的CD8+T细胞，并在实验室中扩增和改造，使其能够更有效地识别和攻击癌细胞，使该方法具有高效并且更加安全的特点。
TCR(T细胞受体)疗法
通过提取患者的CD8+T细胞，并在其中加入一个可以表达T细胞受体的基因，使T细胞产生特异性的T细胞受体，从而能够追踪并杀死癌细胞，目前TCR疗法在杀伤黑色素瘤以及治疗肝癌方面展现出极佳的治疗效果。
CAR-T(嵌合体抗原受体T细胞)疗法
从患者血液中提取T细胞，通过基因改造加入一种制造嵌合体抗原受体的CAR基因，使改造后的T细胞能够特异性地追踪并杀死癌细胞，目前在CAR-T疗法使用最多的T细胞即为CD8+T细胞，并在肿瘤患者治疗方面效果显著。