一文读懂光遗传学技术
一文读懂光遗传学技术
光遗传学简介
光遗传学（optogenetics）是结合了光学（optics）及遗传学（genetics）的技术，可在活体动物甚至是自由运动的动物脑内、脊髓、外周神经内，精准地控制特定种类神经元的活动。光遗传学在时间上的精确度可达到毫秒级别，在空间上的精确度则能达到单个细胞级别。随着光遗传学方法和技术的不断发展与完善，光遗传学被科学界广泛认可，2010年被Nature Methods选为年度方法，同年被Science认为是近十年来的突破之一。这项技术目前在神经科学领域应用非常广泛，未来可能会应用于多种神经和精神疾病的治疗，如帕金森氏病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、精神分裂症等。
光遗传学基本原理
其主要原理是首先采用基因操作技术，将光感基因（如ChR2，NpHR3.0，Arch或optoXR等）转入到神经系统特定类型的细胞中进行特殊离子通道或GPCR的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，如Cl-、Na+、H+、K+，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。例如，光感离子通道视紫红质ChR，细胞接受蓝色激光照射时通道开放，阳离子内流，产生去极化电位，诱发动作电位的发出，激活细胞；如果是盐细菌视紫红质HR这类通道的话，细胞接受黄色激光照射时阴离子内流，产生超极化电位，导致动作电位不易发放，抑制细胞活动；此外，还有一类光激活或抑制的通道optoXR，给予一定频率的光激活后，改变的是细胞内激酶系统，影响细胞活动。
图1. 光遗传学基本原理（Warden MR, et al. Annu Rev Biomed Eng. 2014）
光遗传学实验步骤
- 寻找合适的光敏蛋白
光敏蛋白可分为激活型和抑制型两种，能够引起神经元兴奋或抑制。其光灵敏度和动力学之间存在负相关，激活或抑制能力强弱与时间的精准控制密切相关，所以，根据光敏感蛋白的不同特性寻找合适的光敏感蛋白是首要步骤。
- 将光敏蛋白基因传递给靶细胞
利用转染、病毒注射或转基因动物等方法将编码光敏感蛋白的基因输入到靶细胞中。因为转基因动物操作复杂、周期长且成本高，目前体内神经元表达光敏蛋白主要采用病毒载体注射的方式，多用安全高效的腺相关病毒AAV。
- 对光信号进行时空调控
可采用导入光纤或控制激光的方式将光导入研究区域，选择不同的参数（波长、光强度、频率和占空比）进行光刺激，来达到对神经元活动的时间调控；通过选择性地照射细胞局部的方法来实现对神经元活动的空间调控。
- 实验方法的有效性验证
一般结合膜片钳技术采用电极记录神经元细胞膜内外电压变化来验证光遗传的有效性，并通过行为学测试来评估神经元活动对动物行为的影响，从而将光刺激对神经元、神经回路或动物行为的改变呈现出来。
图2. 光遗传学实验步骤（Buchen L. Nature. 2010. modified）
光遗传学优势
- 时间精确度高
光遗传技术可以通过控制激光使时间精准度达到毫秒甚至亚毫秒级。
- 刺激的强度精确性高
光遗传技术通过控制激光，可以精准地、随时地调节给神经元刺激的强度，这对于某些刺激强度依赖的神经环路研究有不可替代的优势。
- 组织、细胞结构特异性
光遗传技术可通过基因工程方法将光敏蛋白表达在单一来源的特定细胞群，或利用组织特异性启动子将光敏蛋白导入特定的细胞亚群，从而实现大脑内组织结构上的特异性调控。
- 细胞空间投射特异性
光敏蛋白可以顺着感染的神经元胞体向突触生长，甚至跨越一级突触向下一级神经元的胞体生长，因此，利用光遗传技术不仅可以观察各脑区之间的直接投射关系，也可以判断下游神经元是否与被刺激的上游神经元之间存在功能联系，从而进一步描绘出整个神经回路。
- 细胞行为可视化
如果在光敏蛋白后连上荧光报告基因，再导入到大脑执行特定功能区域中的某类神经细胞，则可以在大脑执行特定任务的同时，可视化地调控和记录细胞。
- 作用工具多样
目前人们已经突变了一系列新的光敏感通道，这些通道的时间特性和激发光要求都不同，可根据具体的实验需求进行选择。
- 作用直接
不像DREADDs技术依赖于动物代谢水平，光遗传学技术通过激光操控细胞的激活或抑制，作用直接。
光遗传学应用
光遗传技术让错综复杂的神经学、脑神经学、行为学等逐渐变得可视化，具有非常可观的临床应用前景，如：
- 恢复视力
大多数视觉障碍患者的视网膜中的光线感受细胞都发生了退化，通过光遗传技术修改神经元细胞，使其能够感受光线从而进行“开启”与“关闭”，重获光明。
- 脊髓损伤后功能恢复
光遗传学可以在几毫秒内非常精确地刺激神经元细胞。光敏蛋白在运动神经元中表达，并利用激光激活运动神经元，从而重建受损的神经元回路，有助于恢复运动功能。在未来，光遗传学可能成为治疗脊髓损伤（SCI）患者的一种有价值的工具。
- 治疗神经紊乱类疾病
如癫痫、帕金森症、慢性疼痛症、抑郁症、成瘾症等。已有研究表明光遗传技术可以有效减少动物的帕金森症状。