挑战性重组蛋白纯化策略与实例
挑战性重组蛋白纯化策略与实例
重组蛋白在生物医学研究和药物开发中具有重要应用，其质量控制对实验数据的可靠性和可重复性至关重要。本文详细介绍了多种具有挑战性的重组蛋白纯化策略与实例，旨在为研究人员提供实用的参考指南。
来源：雪球App，作者： 江苏耀海生物CDMO
重组蛋白应用在多种科学领域中，其质量控制（Quality control，QC）对实验数据的可靠性和可重复性至关重要，因此需要根据蛋白质的下游应用和生化特性，检查重组蛋白的特定特征。本文展示了从项目开始时的设计策略结合整个生产过程中的质量控制是获得高质量样本的关键，旨在为研究人员提供一个实用的参考列表，以生产和评估具有特定应用的重组蛋白。
重组蛋白的质量控制要求和策略
工业中的上游重组蛋白处理遵循严格的标准操作规程，但学术界由于缺乏对专业知识和培训的重视，难以保持一致性，导致了关于纯化重组蛋白评估的QC指南的发布，旨在提高数据可重复性并鼓励良好实践。表1概述了特定生物应用或具有特定生化特性的蛋白质的QC要求和可能的策略[1,2]。
表1 用于特定生物应用或具有特定生物特征的蛋白质的QC要求和策略
具有挑战性的重组蛋白纯化实例
1. 核酸结合蛋白
在纯化核酸结合蛋白时，需要引入核酸去除步骤。在细胞裂解过程中，可添加核酸酶如Benzonase®、DNase、RNase，但这通常不足以去除与蛋白质结合的核酸。替代去除步骤：使用PEI或硫酸链霉素沉淀、肝素纯化或离子交换色谱来去除核酸。通过A260nm/A280nm比值监测核酸的存在，比值低于0.6表示蛋白质纯度高，核酸污染最小。对于特别强的核酸结合情况，可以使用变性剂尿素，再进行蛋白质复性。过程中注意使用优质试剂、新鲜无菌缓冲液和干净的柱子（使用前用0.5 M NaOH洗涤）。
2. 小鼠铁蛋白重链1
小鼠铁蛋白重链1用于高分辨率单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）。使用大肠杆菌表达未标记的蛋白，不添加核酸酶情况下超声裂解细胞，70°C加热、硫酸铵沉淀、透析和尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC），初始样品在cryo-EM图像中显示出大量污染物。优化步骤，包括在细胞裂解前和硫酸铵沉淀后的透析过程中添加Sm核酸酶，进行阴离子交换色谱，A260nm/A280nm比值从1.4降低至0.8，SEC后A260nm/A280nm比值0.56，表明蛋白质纯度高，最终获得去除污染物且纯度较高的样品。
3. 嵌合蛋白人dsRBEC
dsRBEC由人类蛋白激酶R的双链RNA结合域（dsRBD）和人类表皮生长因子（hEGF）融合而成。细胞裂解后大部分重组蛋白不溶，污染物RNA妨碍重组蛋白与固定金属离子亲和色谱（Immobilized metal-ion affinity chromatography，IMAC）柱的结合，PEI或硫酸链霉素沉淀、RNase处理或高盐缓冲液等常规方法无法去除RNA。使用含有4M尿素的缓冲液进行细胞裂解，上清液加载到IMAC柱上，从4到0 M尿素的缓慢过夜（柱上复性），用复性缓冲液加咪唑从IMAC柱上洗脱，Superdex75凝胶过滤进行最后的精纯，最终获得具有功能活性的dsRBEC。
4. 结合二价阳离子或其他辅因子的蛋白质
与二价阳离子（如Zn2+、Fe2+、Cu2+）或其他辅因子相互作用的蛋白质，表达过程中添加特定的二价阳离子是至关重要的。纯化过程中，也需添加少量相同二价阳离子，确保蛋白质的稳定性和功能。在处理二价阳离子结合蛋白时，必须避免使用螯合剂（如EDTA、EGTA）和具有螯合性质的还原剂（如DTT、DTE）；必须使用无螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物，以防止二价阳离子的螯合。通过光谱方法（如原子吸收光谱法）确认纯化蛋白中二价阳离子（或其他辅因子）的存在，确保蛋白质的正确折叠和功能。
5. 来自耐热蓝藻含有单一的[2Fe ± 2S]簇的重组铁硫蛋白
植物型铁硫蛋白携带一个单一的[2Fe ± 2S]簇，作为光系统I的电子受体。BL21(DE3)菌株在含有10 mM FeCl3和抗生素的TB培养基中表达重组铁硫蛋白，从IMAC柱上洗脱，使用含有10 mM组氨酸的缓冲液，避免使用咪唑，防止破坏[2Fe ± 2S]簇，阴离子交换和SEC进一步纯化，浓缩至12 mg/ml用于结晶筛选。
6. 淋巴细胞受体LLT1的可溶性片段
野生型LLT1的凝胶过滤图谱显示，除了预期的LLT1非共价二聚体的高分辨峰外，还有一个与聚集物相对应的宽峰（图1A）。质谱分析显示由于未配对的半胱氨酸残基的存在导致蛋白质的错误折叠（图1B）。构建了两个LLT1突变体，一种去除了特定的半胱氨酸残基，另一种引入了另一个半胱氨酸残基以重建半胱氨酸对，第二种突变体稳定、高产、已被结晶，其3D结构证实了含有正确折叠的蛋白质和重建的二硫键的存在（图1C）。在重组蛋白生产中，通过生物物理分析和突变体设计来优化二硫键的形成和蛋白质折叠。
图1 二硫键重建改善可溶性LLT1的折叠和产量
7. 人CLK1激酶的结晶
Cdc样激酶1（CLK1）是一种双重特异性激酶，能够在酪氨酸残基上自磷酸化，并对其底物磷酸化，其三维结构已解析，但程序难以重复，这在激酶研究中并不罕见，制备均匀没有异质磷酸化的CLK1对于结晶和共结晶实验中获得可重复的结果至关重要。CLK1与λ-磷酸酶共表达，去除磷酸化位点上的磷酸盐，带His标签的CLK1通过IMAC纯化，立即用50 mM精氨酸、50 mM谷氨酸和10 mM DTT补充洗脱液以避免聚集，浓缩并在4°C下与TEV蛋白酶孵育过夜，通过含有5%甘油和5 mM β-ME的缓冲液的SEC将正确的寡聚体构象与可溶性聚集体分离，最后过阴离子交换色谱。
8. 作为抗原用的蛋白
用于传统抗体生产的抗原，其正确折叠并不是必需的，因为大多数抗体识别的是线性表位，不受抗原结构的显著影响，变性的抗原也能引发有效的免疫反应，这表明抗原的三维结构对于免疫反应并不是必需的。抗原的纯度必须仔细评估，因为高免疫原性蛋白质的轻微污染可能会导致免疫反应偏离目标抗原。用于筛选结合物库的抗原，骆驼抗体倾向于结合结构表位，这要求用于免疫的抗原保持其三维天然构象，以诱导产生能够识别体内可用表位的抗体。对大型预免疫（合成或原始）文库的淘选，需要确保抗原与最终应用中要检测的目标具有完全相同的结构，避免筛选到针对虚假表位的结合物。对于含有分子间或分子内二硫键的蛋白质，通常选择真核系统进行表达，纯化时必须避免添加还原剂，防止构象变化影响蛋白质功能。对于含有游离半胱氨酸的蛋白质，还原剂在纯化和储存过程中是必不可少的，以免形成人工二硫键。DTT、β-ME和TCEP是最常用的还原剂，对于与DTT或TCEP不兼容的IMAC树脂，建议使用β-ME，并在后续步骤中用其他还原剂替换。含有二硫键和游离半胱氨酸混合物的蛋白质，建议要么根本不还原剂，要么使用非常低浓度的β-ME（2 mM）。二硫键可以通过生物信息学工具从氨基酸序列中确定或预测[3-6]。
9. 易聚集的蛋白质
蛋白质由于各种原因可能是完全不溶、部分可溶或聚集，这种情况可以在表达水平上得到缓解，但在下游纯化步骤中也带来重大挑战。几种策略限制聚集问题，包括筛选不同的细菌菌株、降低培养温度、使用改良培养基或提高溶解度的融合蛋白等。通过在小规模表达和纯化测试中逐步监测单体和聚集蛋白的比例，评估过表达产物的质量，确定导致聚集体最小存在和天然目标蛋白最大产量的条件。预防在蛋白质生产的后期出现聚集问题，应该设计“快速纯化策略”，以尽可能快地生产和储存目标蛋白，优化纯化步骤和储存条件，具体见图2。
图2 降低蛋白质聚集的策略
10. 去除内毒素
内毒素污染对生物处理行业构成重大挑战，内毒素去除方法包括带正电荷的色谱（阴离子交换）、聚阳离子配体（如聚-L-赖氨酸、多粘菌素B）的亲和色谱、添加表面活性剂Triton X-114。纯化过程中注意使用LPS-free水制备缓冲液，使用新柱或仅在其他LPS-free纯化中使用过的柱子。对于内毒素污染，可在0.5 M NaOH中孵育色谱泵/流体系统过夜或在1.0 M NaOH中孵育4小时。使用Limulus amoebocyte lysate (LAL)评估样品中最终的LPS量，并验证其是否低于特定应用所需的限制。
11. 蛋白质复合体
表达和纯化蛋白质复合体最佳条件因情况而异，可以单独表达各个亚基并在体外组装，或者共表达各个亚基以形成功能性蛋白质复合体。对于蛋白复合体的重组表达，构建设计至关重要，以确保引入的标签不会妨碍复合体的正确组装。在整个纯化的步骤中检测复合物的均一性和摩尔质量，以评估复合体的完整性和稳定性。抗原-抗体复合体代表了蛋白质复合物的一个具体例子，共表达可以通过抗体结合来稳定不稳定的抗原，SDS-PAGE和凝胶过滤通常足以评估纯化过程中蛋白质复合体的质量。
结语
蛋白质生产过程（图3）从策略设计开始，考虑目标蛋白质的生化特性和预期的下游应用。将基因克隆到合适的表达质粒后，验证序列确保正确性；在所选宿主生物中确定最优化的表达条件，包括筛选各种参数如表达菌株、表达培养基、生长温度、时间等；找到获得可溶性蛋白质的最佳条件后，进行大规模蛋白质纯化，选择合适的色谱方法和缓冲液条件；在整个过程中进行质量控制，确保目标蛋白质稳定、不聚集并且处于天然状态。纯化的蛋白质可以用于各种下游应用，如生物物理表征、相互作用研究、结构分析、细胞实验等。
图3 蛋白质生产流程