单细胞分析揭示协同作用的肿瘤微环境动态有助于确定胰腺癌的亚型

单细胞分析揭示协同作用的肿瘤微环境动态有助于确定胰腺癌的亚型

胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症死亡的主要原因之一，5年生存率仅为10%。近年来，随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展，研究人员能够以更高的分辨率和通量分析肿瘤微环境（TME）。一篇发表在《Nature Communications》上的研究论文，通过整合来自七项独立研究的92个单细胞RNA-seq样本，构建了一个可重现的PDAC图谱，揭示了肿瘤-TME的相互依赖性，并发现了活化基质患者与“正常”基质患者在免疫和基质图谱上的显著差异。

研究背景

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命的癌症类型，5年生存率仅为10%。由于PDAC肿瘤的分子分析通常受到肿瘤细胞有限以及与内分泌、外分泌和免疫细胞混合的大量基质的存在而被阻碍。为了更好地研究PDAC肿瘤细胞，已经使用了激光捕获显微切割、类器官和异种移植物等替代方法。作者之前对大量RNA-seq样品进行了虚拟显微切割，确定了“基底样”和“经典”肿瘤亚型的预后基因特征，强调了PDAC患者癌症内在异质性的重要性。此外，作者描述了“正常”和“激活”的基质亚型，后者的结果更差。

近年来，肿瘤微环境（TME）在寻找替代治疗方式方面引起了极大的兴趣。微流控和单细胞RNA测序（scRNA-seq）的进步使得在单个细胞水平上对癌症TME进行高通量和高分辨率分析成为可能。这使研究人员能够研究肿瘤异质性，同时克服盲源分离的挑战。几项对胰腺组织的单细胞研究有助于揭示以前未解决的生物学和疾病过程。例如，发现了新的祖细胞样导管细胞，它们分化为成熟的导管、腺泡或胰岛细胞。癌症相关成纤维细胞（CAF），包括肌成纤维细胞 CAF（myCAF）、免疫原性 CAF（iCAF）和抗原呈递 CAF（apCAF）被证明在细胞外基质产生、免疫抑制、脉管系统重塑、肿瘤增殖和转移中发挥作用。

实验设计

研究中使用了7个数据集，包括Peng、Powers、Qadir、Segerstolpe、Lin、Moncada和Muraro的数据集。发现数据集由四个数据集整合：Peng、Powers、Qadir和Segerstolpe。验证数据集由三个数据集整合：Lin、Moncada和Muraro。

研究结果

单细胞PDAC的综合meta分析提供了丰富而详细的TME图谱

研究使用Seurat流程处理本地和公共数据集整合的正常和PDAC衍生患者的综合胰腺scRNA-seq数据集。跨数据集的患者贡献了独特的细胞类型亚群组成，这些亚群反映在初始研究目标、患者临床状况和可变组织处理中，使研究人员能够观察到一组更全面的细胞类型。图谱的UMAP显示了细胞在患者和独立数据集之间的成功整合，并提供了来自PDAC组织活检的丰富组成和表型信息。可视化典型标记物可识别主要细胞类型。这些细胞类型被进一步细化为不同的亚群，以便进行更深入的分析。这些细胞类型还被验证为与原始研究中先前建立的标记一致。

分泌组的交叉TME分析突出了关键的信号转导轴和标志物

研究调查了上述细胞类型中所有已知为分泌配体和受体的差异表达转录本。值得注意的发现包括qPSC中的CCL21表达、iCAF中的IL6表达和myCAF中的INHBA表达。CXCL12是另一种趋化因子，在免疫原性CAF和静脉EC中表达。相应的受体CXCR4在早期（预激活）CD8+T细胞和记忆B细胞中表达最高。动脉、毛细血管和静脉内皮亚群显示血管生成和有丝分裂因子（即VEGF、INSR）和免疫调节因子（如LIFR、CX3CL1和CCL23）的上调。单核细胞来源的DC表达CSF2R，CSF2R是csCAF和myCAF分泌的CSF2受体（GM-CSF）。SPP1+巨噬细胞表达MRC1（M2标志物）和TREM2，与肿瘤浸润CD8耗竭相关。LAMP3+DC的LGALS9（半乳糖凝集素-9）表达最高，其促进表达TIM-3（HAVCR2）的巨噬细胞的M2极化。

用于人类和小鼠数据的自动单细胞分类器

研究使用发现数据集的单细胞网络训练了一个多类随机森林分类器。针对内部的99,518个单元验证集进行测试，实现了96.4%的模型准确率和98%的AUPRC。另一方面，研究使用来自三项独立研究的验证数据集训练了第二个随机森林模型。最后，两种模型在研究中的交叉验证表明，两个模型内的高的标签一致性（验证率：92.6%，训练率：95.8%）和高的注释的概率。

正常和激活的基质特征反映了两个不同CAF群体之间的患者水平梯度

研究注意到“激活”成纤维细胞特征表达在myCAF、“反应性”基质和经典CAF（cCAF）中的广泛重叠。对免疫原性亚群的仔细检查显示，iCAFs和最近描述的csCAFs确实是具有重叠特征的不同组。基质的其余细胞代表具有CAF1/CAF2特征的2个PSC组。此外，两种基质亚型特征的pseudobulk表达热图显示从正常基质到逐渐升高的活化状态的梯度。一致性聚类将患者分为正常或活化基质，以及混合中间组。基质亚型特征评分突出了myCAF中激活表型的富集，而在PSC中发现了正常特征。

PDAC TME的细胞组成与基质亚型相关

基于CAF和PSC亚群中亚型特征的不同富集，研究假设基于基质亚型的差异信号转导最终导致不同的TME组成和致瘤表型。研究观察到主要活化基质表型的患者在基质内具有较高百分比的myCAF和csCAF，而正常亚型患者具有较高的PSC。髓系区室的类似比较显示更高的SPP1+和GRN+TAM、驻留巨噬细胞和具有活化基质的mo-DC，而经典活化的单核细胞和杀瘤巨噬细胞（M1样，CIBERSORT）在正常亚型中更高。活化队列的淋巴细胞显示出更高比例的CD4+T-Regs，以及更高的T细胞特征评分，而正常患者的整体T细胞更高，CD8+T（细胞毒性和功能失调）、幼稚CD4+T细胞百分比和效应相关特征评分增加。

TME信号转导控制由基质亚型区分的抗肿瘤和促肿瘤表型

在激活的亚型中，myCAFs的表达与分泌的INHBA一致，后者参与上皮细胞中的SMAD2/SMAD3通路。此外，癌症进展和化疗耐药相关的OXT/OXTR（催产素）基因在CAFs和肿瘤细胞之间高表达。肌成纤维细胞CAF（myCAFs）和内皮TGFBR1被确定为基底样肿瘤细胞TGFB2的潜在靶标。IL19诱导的促纤维化STAT3通路在激活的myCAF中由IL20RA显示。免疫检查点分子PDCD1LG2（PDL2）和TNFSF4（OX40L）在myCAF中表达，而CD8+T细胞和T-Regs分别表达匹配的受体对（PD1和OX40）。活化的TME的髓样细胞描绘了M2极化，其特征是GRN+TAM中CD209的表达。myCAFs和内皮细胞分别表现出FGF7/FGFR2和VEGFC/FLT4信号的上调，促进细胞迁移和淋巴生长。内皮细胞似乎通过激活的TME中的IL1B信号促进趋化性，并额外表达巨噬细胞调节基因，包括MIF和MARCO。

肿瘤亚型特征分离PDAC单细胞，并与不同的TME活性相关

从正常来源和PDAC来源的组织聚集的上皮细胞被亚聚类以得到更精细的细胞类型注释，即揭示腺泡、正常导管、炎症性化生和肿瘤亚群。按样本来源（正常或肿瘤）拆分数据显示肿瘤样本中肿瘤和化生的富集。UMAP密度图显示了与细胞注释相对应的典型标记基因的清晰定位。值得注意的是，KRT17（basal）和TFF3（classical）标志物的表达严格分离到肿瘤簇中。使用pseudobulk的上皮分析确定了基础型或经典表型的患者，在某些情况下，在同一患者的组织中检测到了两者，证实了最近的PDAC类器官亚型二分法的工作研究。研究使用前1,000个可变基因进一步分析肿瘤上皮，并将数据投影到3D UMAP空间，显示了化生和肿瘤之间的桥梁，可能突出了晚期致瘤分化。在化生簇的边缘也观察到正常的导管细胞，暗示了主要正常导管簇的基本转变。化生簇呈现早期恶性肿瘤标志物，如MMP7和MUC6，并独特表达肿瘤抑制基因，这些基因指向针对细胞损伤或突变的稳态机制。接下来，研究对肿瘤亚群进行亚集，并对每个单细胞的基础/经典亚型表达进行评分，以表明癌细胞相应地与患者表型匹配，而一些患者同时混合了基础和经典，正如其他人所观察到的。“混合”亚型患者的细胞代表了一种中间状态，而不仅仅是两种肿瘤亚型的混合。这种对“混合”肿瘤患者和“中间”亚型的观察结果与最近的组织学研究一致。

基于跨隔室的特征在患者之间的相关性

研究分析了一种细胞类型的存在如何与其他区室中的表型相关联。亚种群比例的相关性分析揭示了两个主要的相关特征模块。在第一个模块中，正常基质和经典细胞类型丰度均呈正相关。PSC基质比例也与经典上皮比例显著相关，与正常亚型观察结果一致。值得注意的是，该组还与细胞毒性CD8+T细胞和FSIP2+TAM呈正相关。第二个模块将基础特征和活化特征以及SPP1+TAM、myCAF、T-Regs和免疫原性CAF的增加组合在一起。

研究进一步扩展了这一分析，从最近的出版物中收集了代表典型PDAC亚型、通路、免疫调节和代谢特征的基因特征列表。当观察区室特异性表达特征而不是细胞类型比例时，研究发现“基底样/激活”特征与上皮/内皮TGFB产生增加的证据相关，而TGFB反应特征在基质中升高。此外，还观察到基质内的基质金属蛋白酶特征和骨髓细胞的IL17信号传导。其他“经典/正常”TME谱包括经典和正常亚型特征以及髓系和上皮区室中升高的IFNG反应特征。该模块包括腺泡到导管化生、刺猬和视黄醇信号传导的特征。如前所述，代谢比较显示糖酵解特征组与基础模块相关，而氧化磷酸化与经典模块相关。淋巴细胞特征包括跨内皮迁移、肿瘤浸润淋巴细胞和PD1信号传导。最后，与阳性化疗反应相关的类器官衍生特征与正常/经典TME相关。总的来说，该分析提供了一个相关细胞类型特异性信号转导的联合模型，描述了PDAC中两种截然不同的TME。

研究结论

这项研究通过整合多个单细胞RNA-seq数据集，构建了一个全面的PDAC肿瘤微环境图谱。研究揭示了活化基质患者与“正常”基质患者在免疫和基质图谱上的显著差异，为理解PDAC的异质性和开发新的治疗策略提供了重要线索。研究还提供了一个预训练的细胞类型分类器和一个基于亚型的信号因子图谱，这些资源将有助于未来的研究。

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