膜片钳技术及应用

膜片钳技术及应用

膜片钳技术是一种用于研究生物膜上离子通道电活动的微电极技术，它通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触，采用电压钳或电流钳技术对生物膜上的离子通道的电活动进行记录。膜片钳技术是一种特殊的电压钳/电流钳技术。

膜片钳技术的基本原理

膜片钳技术与电流钳、电压钳技术在命名上并不完全一致，后两者是从电学概念的角度命名的，而“膜片钳”主要是从机械物理学的角度命名的。从字面上理解，膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。

膜片钳实验系统

膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同而有所区别，但其基本组成是相同的，包括膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器以及防震台和屏蔽罩等。

• 倒置显微镜
• 防震台
• 屏蔽罩
• 三维操纵仪

膜片钳实验流程

膜片钳实验方法包括：制备玻璃微电极；制备细胞标本；建立高阻封接；电流记录。

制备玻璃微电极

拉制微电极材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。要求：玻璃毛胚外径1.31.7㎜，内径1.01.2㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁电容就越小，噪声也就越低。

拉制方法：两步拉制法。第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形成一个细管，即拉制电极的颈部；第二步：使用较低的热度，拉断细管部，成为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制电极的尖端。一般拉制出的玻璃微电极尖端直径为1~5μm。

涂胶和抛光对玻璃微电极进行涂胶和抛光。涂胶（疏水性涂料，如硅酮树脂）主要是为了减小电极的跨壁电容。

抛光是指将玻璃微电极靠近加热的铂丝，从而使电极尖端变光滑的过程。抛光主要目的是防止电极尖端刺破细胞，利于高阻封接。

制备细胞标本

从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固程度不同，采用的分离方法也不完全相同。大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及清洗等步骤。

建立高阻封接

在显微镜下找到微电极，移动三维操纵仪，使电极尖端接触细胞，形成高阻封接。高阻封接形成是进行膜片钳实验的关键一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程，可以采用软件发出1mV脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流，再通过显示屏，观察电极电流幅度的变化来确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显示器上可见一直线。

膜片钳技术的四种基本记录模式

• 细胞吸附膜片(cell-attached patch)
  将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流，称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整性，

• 全细胞记录法(Whole-cell recording)
  在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。

• 内面向外膜片(inside-out patch)
  高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。

• 外面向外膜片（Outside-outpatch）
  在全胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成。

膜片钳技术的应用

2008年，第二军医大学基础部生物物理研究所的研究人员采用膜片钳和激光扫描共聚焦显微镜，同步实时系统观察心肌细胞钙离子的释放。膜片钳能获得膜上钙离子通道的离子电流，但不能对离子的移动进行实时定位，不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微镜可以对钙离子的移动进行实时定位,但无法对单个离子通道的离子移动信号(如单通道电流)进行分析。

大鼠心室肌细胞L2型钙通道电流(ICa,L)

采用膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步