SH-SY5Y细胞培养与基因编辑完全指南

SH-SY5Y细胞培养与基因编辑完全指南

SH-SY5Y细胞系源自一位4岁女孩的骨髓样本，是一种人类神经母细胞瘤细胞系。它们在神经科学研究领域扮演着重要的角色，尤其是在研究帕金森病等神经退行性疾病的机制。科学家还可通过基因编辑技术，可以深入探究特定基因在神经元的功能及其在疾病中的作用。

细胞基本信息

• 细胞名称：SH-SY5Y（人神经母细胞瘤细胞）
• 细胞形态：上皮样，贴壁细胞与悬浮细胞同时存在
• 细胞培养条件：DMEM＋10%FBS（优质胎牛血清）＋1%P/S
• 培养环境：气相：空气，95%；CO2，5%；温度：37℃
• 换液频次：2-3次/周
• 传代比例：1:2-1:3

图1 细胞生长正常图片（细胞呈上皮样，多数细胞贴壁生长，少数悬浮于培养基中，培养过程中绝大部分细胞呈现贴壁状态为正常现象；贴壁细胞会有短触角延伸出来）

图2 细胞生长状态差图片（细胞形态发生改变，如细胞变圆、拉长或失去触角；聚团生长过度；死细胞成团漂浮）

SH-SY5Y细胞培养

细胞复苏

1. 准备：取7mL完全培养基于离心管中备用。
2. 解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴。
3. 离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液。
4. 重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。
5. 培养：将培养皿或培养瓶置于37℃、5% CO2培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。

细胞传代（以T25瓶为例）

1. 当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次
2. 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育1-2分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化
3. 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中
4. 1100 rpm室温离心4分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞
5. 细胞按照1:2-1:3比例传代，传代第二天观察细胞状态

细胞冻存

1. 收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中
2. 离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清
3. 重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息
4. 降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

SH-SY5Y培养注意事项

1. 该细胞培养时以悬浮细胞和贴壁细胞的混合形态生长。如果培养过程中多数以贴壁细胞生长，悬浮细胞占少数或几乎没有，可按贴壁细胞细胞的方式进行消化和培养。
2. 如果培养过程中发现悬浮的细胞数量比较多，或者细胞聚团且生长缓慢，则需要在换液和传代时通过离心收集这些悬浮细胞，并且尽快更换高质量的血清以促进细胞贴壁和生长。
3. 该细胞对血清质量敏感，建议使用高质量胎牛血清进行培养。

常见问题解答

细胞状态差如何调整？

1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，血清浓度可根据细胞状态适当调整。
2. 细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气相条件是否正常。
3. 避免使用过期或长时间存放的培养基，新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕。
4. 细胞传代操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤。

细胞结团如何调整？

1. 调整细胞密度

• 控制接种密度：控制接种密度不要过高，以减少细胞聚集成团的机会。一般建议细胞密度达到80%左右进行传代。
• 低密度传代：可以尝试低密度传代，即减少每次传代的细胞数量，这有助于细胞在培养瓶中更均匀地分布。

2. 优化培养条件

• 培养基选择：确保使用正确的SH-SY5Y细胞生长的培养基，并根据需要调整培养基的成分，如血清浓度等
• 确保培养环境适宜，如稳定的温度、湿度和CO₂浓度等

3. 注意消化操作

• 延长消化时间：如果细胞结团是由于消化不充分引起的，可以适当延长消化时间，但要避免过度消化导致细胞损伤。
• 轻柔吹打：在消化过程中和传代时，用移液枪或吸管轻柔地吹打细胞悬液，以分散细胞团块。注意吹打力度要适中，避免产生气泡

基因编辑Tips

SH-SY5Y细胞转染时注意事项：

1. 确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，细胞密度一般处在80-90%。
2. 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害。
3. 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团。
4. 细胞进行实验时活率≥80%。

电转法需注意：

1. 电转法进行实验时控制好电转细胞量，电转后接种到合适的培养皿里。
2. 用电转法进行实验时要保证电转后细胞贴壁率≥70%。
3. 用电转法进行转染时需控制好实验时间，电转全程不宜过长。

慢病毒法需注意：

1. 慢病毒法进行实验时要控制好感染前的细胞汇合度，不可过高。
2. 选用病毒法进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI；感染前添加助染剂Polybrene。
3. 对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。

SH-SY5Y铺单克隆实验注意事项：

1. 确保铺克隆实验前细胞状态正常，建议控制细胞汇合度在70%左右
2. 铺克隆时细胞活率≥80%
3. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低
4. 稀释细胞计数后结果最好落在110^6-210^6之间

图3 慢病毒感染SH-SY5Y细胞

图4 SH-SY5Y细胞单克隆