免疫组织酶化学染色技术：原理、步骤与注意事项详解

免疫组织酶化学染色技术：原理、步骤与注意事项详解

免疫组织酶化学染色技术（简称免疫组化）是现代医学检验中一项重要的技术手段，广泛应用于肿瘤诊断、病理分型和治疗方案的选择。本文将详细介绍免疫组化的基本原理、操作步骤及注意事项，帮助读者深入了解这一技术在医学领域的应用价值。

免疫组化的基本概念

免疫组化是一种通过特异性抗体与组织内抗原结合，进而检测特定蛋白质分布的技术。与传统的HE染色相比，免疫组化能够更精确地识别细胞成分层面的差异。

MLH1 微卫星 细胞核阳性

CgA Chromogranin A嗜铬素A 细胞浆

CD38 表达在细胞膜

免疫组化在医学领域具有重要应用价值：

1. 恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断
2. 确定转移性恶性肿瘤的原发部位
3. 对某类肿瘤进行进一步的病理分型
4. 软组织肿瘤的治疗分类
5. 发现微小转移灶
6. 为临床提供治疗方案的选择

免疫组化的基本原理

免疫组化的基础是抗原-抗体反应的特异性。通过选择特异性抗体（带有特殊显色剂）与组织内的抗原结合，然后通过化学反应使显色剂显色，从而观察到特定蛋白质的分布情况。

免疫组化SP法的操作步骤

SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）是目前应用最广泛的方法之一，具有操作简单、显色效果好等特点。

手工操作步骤

1. 切片脱蜡、水化
2. PBS洗3次各5分钟
3. 切片浸泡在3%H202，10分钟
4. 流水冲洗后，PBS洗3次各5分钟
5. 修复，暴露抗原
6. PBS洗3次各5分钟
7. 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
8. 滴加一抗孵育，30~60分钟37℃或者4℃环境8-12h
9. 复温，待切片温度到达室温后进行下一步
10. PBS洗3次各5分钟
11. 二抗孵育，37℃下20-30分钟
12. 恢复室温后，PBS洗3次各5分钟
13. DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度
14. PBS或自来水冲洗10分钟
15. 苏木精衬染
16. 脱水、透明、封片、观察结果

全自动免疫组化仪BOND-MAX操作步骤

1. 开机，检查系统运行状态，检查试剂剩余量并补充或倒掉废液
2. 添加病例，打印标签和粘贴标签
3. 玻片置于玻片架的任意一个空余的卡槽上
4. 将干净的covertile轻柔的放置在玻片上，注意将柄部的钥匙对准卡槽上的锁孔位置，准确放置；拨动covertile,检查是否放置到位
5. 所有玻片放置完毕后，将玻片架保持水平轻轻推入仪器中，点击下方的装载/卸载按钮
6. 选择试剂并推入到试剂仓内
7. 等待设备扫描玻片和试剂二维码，确认完毕后，点击屏幕下方开始运行
8. 当系统状态显示染色完成时，该玻片架下指示灯显示为绿色，点击仪器上的卸载按钮，玻片架升起，轻轻抽出玻片架
9. 取下Covertile收集在固定地方等待清洗，将玻片取下进行后续操作
10. 染好的玻片，流水稍冲洗后，脱水、透明、封片、观察结果

徕卡BOND-MAX

操作原理详解

1. 修复：目的是使组织上的抗原暴露。组织在固定过程中，部分抗原会发生蛋白交联和醛基封闭，导致抗原决定簇的三维结构改变，影响免疫活性。通过修复步骤可以恢复抗原的免疫活性。

2. 3%H202浸泡：目的是阻断内源性的过氧化物酶。在使用HRP作为显色系统的IHC操作中，需要对内源性过氧化物酶进行灭活，以避免产生假阳性结果。

3. 封闭：为了防止抗体与组织的非特异性结合，造成假阳性。常用方法是使用PBS稀释的5%山羊血清进行封闭。

4. PBS的作用：磷酸缓冲盐溶液（PBS）在免疫组化染色中主要用于每个步骤后的洗涤。它能保证离子浓度和pH值，为抗原抗体反应创造良好的环境，同时有效减少非特异性着色，使背景更干净清晰。

注意事项

免疫组化操作需要高度的精确性和细致性，从标本离体到制片完成，涉及近30个需要质控的步骤。虽然现在已实现全自动化染色，但染色前的固定、切片、烤片，以及染色后的保存和结果判断，仍需要技术员的经验积累。

对于进行免疫组化的技术员要求：

1. 独立手工操作＞6个月，每个月不低于3000张
2. 独立手工操作1w张切片
3. 染色优良率≥95%以上

常见注意事项

1. 操作前

• 10%中性缓存福尔马林固定
• 脱蜡水化的过程要彻底
• 切片厚度在2.0~3.0微米，连续切片
• 切片机整洁、水要清洁
• 捞片时水分要完全沥干再烤片，烤片温度应6870℃左右，13小时
• 不要直接用手接触切片表面
• 检查操作时所用的所有试剂，最好是新鲜配置

2. 手工操作时

• 组织必须完整的浸泡在试剂里
• 所有需要使用PBS的步骤，前一步的试剂一定要用PBS冲洗干净
• 温度、时长主要根据一抗的使用说明书操作
• 复温时切片需要自然冷却
• DAB液不宜配置过浓
• 在显微镜下把握显色程度，避免背景着色过深

3. 设备操作时

• 标签打印和粘贴要准确
• 及时添加试剂和倒去废液
• 按设备要求定期清洁
• 开放性试剂做好出入库记录和低温保存
• 盖板及时清洁
• 操作过程中，不要断电，也不要随意点击或触摸设备上的按键
• 设备运行时，若有感叹号提示，应及时查看并处理

4. 染色完成后

• 检查切片是否完整，染色是否正确
• 及时封片，免疫组化切片要避光保存
• 对于染色不佳的情况，要找出问题并解决之后再次染色

常见问题及解决方案

通过一些染色片了解常见问题：

右图DAB染色过度，背景过深

• 组织下面有气泡：脱蜡时破裂，需确保脱蜡过程彻底
• 组织褶皱：展片时水温不够或时间过短，需确保组织展平后再捞片
• 黑色絮状物：可能是水里、试剂或切片上的杂质，需及时更换并使用干净的载玻片
• 试剂未完全覆盖组织：会导致边缘效应，需确保试剂充分覆盖
• DAB染色过度：背景过深，需控制显色时间

免疫组织酶化学染色技术是一项精细且复杂的实验技术，其结果直接影响临床诊断和治疗决策。通过本文的介绍，希望能帮助读者更好地理解这一技术的原理和应用，为医学检验工作提供参考。