mRNA技术及其CAP制备

mRNA技术及其CAP制备

mRNA（信使核糖核酸）技术是近年来生物医学领域的重要突破，其在疫苗研发、基因治疗等领域展现出巨大潜力。要理解mRNA治疗技术，首先需要了解mRNA的基本结构及其功能。本文将从mRNA的结构组成、翻译机制、CAP结构的重要性以及CAP的合成工艺等方面，为您详细介绍mRNA技术的核心原理。

mRNA结构组成

mRNA是由转录过程产生的，真核生物中RNA聚合酶在体内将基因转化为初级mRNA转录本时合成前体mRNA，通过加工进一步成为成熟mRNA。成熟mRNA包括编码区、非编码区（UTR）、poly(A)尾和5′帽结构（图3），它们可以被核糖体识别并被tRNA携带产生蛋白质。

图3：mRNA结构组成

mRNA翻译和衰变

真核mRNA翻译起始是一个精细调控的过程，涉及到组装一个多蛋白及RNA复合物，指导核糖体到起始密码子。而mRNA在核糖体中会被解码，产生特定的氨基酸链。研究发现翻译过程和mRNA衰变过程之间存在一种平衡（图5）。

图5. mRNA衰变的机制

先前的研究表明，结构元件与mRNA的衰变密切相关，尤其是5 'CAP和poly(A)尾。基于这些功能元件的重要性，有大量研究集聚焦于mRNA结构的优化，如开发一系列5 '帽类似物、改变poly(a)尾长度等。

mRNA设计与CAP介绍

这一部对mRNA设计进行了介绍。首先介绍的是5 'CAP。mRNA 的 5' 端称为CAP的甲基化结构组成。帽决定了蛋白质合成的速率，因为没有帽的 mRNA 与核糖体的结合很差。5 '帽位于mRNA的5 '端，甲基化程度不同（图6），许多mRNA结构优化策略致力于优化帽类似物。接着介绍的是poly(A)尾。Poly(A)尾通常由10-250个腺嘌呤核糖核苷酸组成。Poly(A)尾是mRNA的动态添加物，其的长度对mRNA翻译效果和蛋白表达起着至关重要的调控作用。

介绍5′-UTRs和3′-UTRs，mRNA 3′和5′末端的UTRs不编码蛋白但在调控mRNA翻译和蛋白表达中起重要作用。UTRs参与mRNA的亚细胞定位，调节mRNA的翻译效率和稳定性。5′-UTRs和3′-UTRs共同调控蛋白质的表达水平，5′-UTRs主要参与启动翻译过程，而3′-UTRs主要影响mRNA的稳定性和半衰期。对开放阅读框（ORF）进行了介绍，ORF的设计主要集中在密码子的优化和功能肽的引入以及复制过程。

图6. 商业化和常用的Cap

5' Cap保护大部分真核细胞mRNA的5'端都有一个反式7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷（m7Gppp)的起始结构，称为5'-帽结构，原核生物mRNA没有这种结构。5'-CAP结构对稳定mRNA及其翻译具有重要意义，它将5'端封闭起来，可免遭核酸外切酶水解；还可作为蛋白合成系统的辨认信号，被一种帽子结合蛋白识别并结合，促使mRNA与核糖体小亚基结合，进而启动翻译过程。mRNA不被外切酶降解，与3'端的poly A尾、poly A结合蛋白（PAPB）和翻译起始因子蛋白协同作用，起始蛋白质的翻译。体外转录（In Vitro Tranion，IVT）的加帽是常用的加帽方式，可以在IVT时加帽（即共转录加帽），也可以在IVT结束后加帽（即酶法加帽）。

应当注意mRNA可以被反向加帽，从而导致快速地降解和较低的翻译效率。为了避免反向加帽，抗反向盖帽类似物（anti-reverse cap analogs，ARCA）被开发和使用，从而确保加帽的正确性。过去的几年时间，更多的核苷酸修饰致力于使用ARCA，如新开发的Clean Cap类似物。所以，稳定的、正确方向的帽子结构应当被考虑到高效的mRNA疫苗中。

CAP结构有一个固定的组成示意图（保护基团、修饰基团、碱基序列可调整）：（图7）

图7：mRNA CAP type

m7G+5',5'-triphosphate chain+the first transcirbed nucleotide

在mRNA 5'末端核苷酸不同部位可发生甲基化，从而形成3种帽子结构：

Cap 0 (GpppN1 +mRNA)
Cap 1 (GpppN1m+mRNA)
Cap 2 (GpppN1mN2m)

帽子结构对于mRNA来说，就像是一定钢盔，既可以保护mRNA免遭荼毒，又能够通过化学修饰在钢盔上加上烙印，便于被其他成员识别。mRNA疫苗研发中，通过共转录方式加帽，能够更加迅速提升mRNA疫苗产能。

合成CAP的工艺介绍

合成CAP的工艺路线多种，但大体路线基本一致（图8）。

图8：合成CAP工艺路线示意图

所用到的基础原料

因mRNA制备中修饰基团、保护基团、序列、后期脱保护等原因，会有多种变体。以下只列出部分基础原料（图9），都可大规模提供。可继续二次组装，多次组装。

图9：CAP的部分基础原料