应用基因集富集分析和加权基因共表达网络分析方法分析类风湿关节炎的枢纽基因及意义

应用基因集富集分析和加权基因共表达网络分析方法分析类风湿关节炎的枢纽基因及意义

类风湿关节炎（RA）是一种慢性、进行性的全身自身免疫性炎症疾病，主要影响周围关节，早期累及关节滑膜组织。目前，传统的血清标志物检测方法仍有30%的患者为阴性，而近年发现的血清生物标志物对RA诊断的敏感性和特异性较低，不适于临床推广。因此，本研究应用基因集富集分析和加权基因共表达网络分析方法分析RA的枢纽基因及其意义。

研究方法

从GEO数据库下载GSE1919、GSE55235数据集，使用R软件“limma”包初筛差异表达基因、“clusterProfiler”包进行加权基因共表达网络分析，取交集基因作为候选枢纽基因。将结果导入String数据库构建蛋白质相互作用网络，Cytoscape软件cytoHubba插件筛选枢纽基因，并进行基因本体分析、京都基因与基因组百科全书通路富集分析。同时对2个数据集用基因集富集分析方法进行京都基因与基因组百科全书通路分析。

研究结果

1. 共筛选出10个枢纽基因，其基因本体分析集中在淋巴细胞分化、T细胞分化、质膜信号受体复合物、主要组织相容性复合体蛋白结合等生物学功能；
2. 京都基因与基因组百科全书通路富集于T细胞受体信号通路、Th1辅助细胞和Th2辅助细胞分化、Th17辅助细胞分化、肿瘤细胞程序性死亡-配体1表达和程序性死亡受体1检查点通路及原发性免疫缺陷5条通路；
3. 基因集富集分析2个数据集类风湿关节炎样本发现3条共同通路：哮喘、自身免疫性甲状腺疾病和细胞黏附分子通路显著上调；
4. 受试者工作特征曲线结果显示，5个基因(CD27、IL2RG、CD8A、LCK、NKG7)对诊断类风湿关节炎具有良好的特异性和敏感性(曲线下面积> 0.85)；
5. CD4可能是多能的基因网络协调员，在免疫反应中发挥重要功能。

研究结论

本研究通过基因集富集分析和加权基因共表达网络分析方法，成功筛选出10个与类风湿关节炎相关的枢纽基因，并对其生物学功能和信号通路进行了深入分析。研究结果表明，这些枢纽基因在淋巴细胞分化、T细胞分化等生物学过程中发挥重要作用，且与T细胞受体信号通路、Th1/Th2/Th17细胞分化等免疫相关通路密切相关。此外，研究还发现5个基因(CD27、IL2RG、CD8A、LCK、NKG7)对类风湿关节炎的诊断具有较高的特异性和敏感性，为该疾病的早期诊断和治疗提供了新的思路和方向。

图表说明

1. 芯片间归一化质控：使用R“limma”包中的normalize BetweenArrays( )函数分别对3个GEO数据集的数据进行芯片间归一化处理，见图1。
2. 差异表达基因的筛选：应用 R 软件对GSE1919和 GSE55235数据集进行标准化处理，以|Log2FoldChange|> 0.5且 P < 0.05 为初筛条件分析差异表达基因。GSE1919 芯片筛选出318个差异表达基因，其中174个上调基因、144个下调基因，见图2A，B。GSE55235 芯片共筛选出 2 147个差异表达基因，其中1 224个上调基因、923个下调基因，见图2C，D。
3. 构建WGCNA筛选类风湿关节炎表型相关枢纽模块：通过R分别对 GSE1919和 GSE55235数据集进行样本聚类，两样本均展现出较好的聚类趋势。计算GSE1919芯片软阈值=9，基于软阈值构建基因模块，见图3A；构建共表达矩阵网络，并通过动态混合剪切得到11个以热图方式呈现的基因模块，见图3B；选择与类风湿关节炎相关性最强的蓝绿色模块标记为“GSE1919模块基因”进行后续分析，见图3C。该模块包括1 711个基因，与类风湿关节炎表型相关性最强(r=0.95，P < 0.01) ，见图3D。
4. 筛选与类风湿关节炎相关的枢纽基因：通过韦恩图绘制GSE1919差异基因、 GSE55235差异基因、GSE1919模块基因和GSE55235模块基因的交集，筛选出150个交集基因，见图5。通过 String-Cytoscape-cytoHubba 分析 150个交集基因网络，MCC 算法筛选分值最高的10个基因为枢纽基因：CD4、CD27、 IL2RG、CD247、CD8A、CD79A、CD3D、CD52、LCK和NKG7，见图6。
5. GSEA分析结果：GSEA用于评估预定义的基因集在两种生物表型(例如对照组和类风湿关节炎组)之间的差异是否具有统计学意义。标准化处理 GSE1919(10个样本包含8 621个基因)和 GSE55235(13个样本包含12 548个基因)矩阵数据，根据分析结果的过滤阈值，2个数据集类风湿关节炎样本有3个共有KEGG通路：哮喘、自身免疫性甲状腺疾病和细胞黏附分子均显著上调，见图9。
6. 外部数据集验证：验证枢纽基因在其他类风湿关节炎患者滑膜组织中的表达。选择GSE55457为测试数据集，分析10个枢纽基因在健康对照与类风湿关节炎患者滑膜组织的表达量。除CD4之外(P=0.78)，其余9个枢纽基因(CD27、IL2RG、CD247、CD8A、CD79A、CD3D、CD52、LCK、NKG7)在类风湿关节炎组的表达量均显著高于对照组(P < 0.01)，见图10。
7. 受试者工作特征曲线评估枢纽基因对类风湿关节炎的诊断价值：做受试者工作特征曲线，计算曲线下面积。曲线下面积> 0.85的5个基因(CD27、IL2RG、CD8A、LCK、NKG7)特异性和敏感性较高，对类风湿关节炎患者具有较高的诊断价值，见图11。