RNA提取：TRNzol法原理步骤及常见问题

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RNA提取：TRNzol法原理步骤及常见问题

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RNA提取是分子生物学实验中的一项基础技术，其中TRNzol法是最常用的RNA提取方法之一。本文将详细介绍TRNzol法的实验原理、具体操作步骤、注意事项以及常见问题的解决方案，帮助读者更好地掌握这一实验技术。

RNA是一种核酸分子，在生物学中扮演着重要的角色。在细胞内，RNA不仅具有转录和翻译的功能，而且在调控基因表达、细胞信号传导以及病理机制等方面也发挥着重要的作用。目前普遍使用的RNA提取方法有两种：Trizol法和柱离心法，本文主要介绍一下Trizol法的基本原理及实验步骤。

Trizol法的实验原理(异硫氰酸肌-酚-氯仿一步法)

TRIZOL 试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性。试剂主要成分为异硫氰酸和苯酚，其中异硫氰酸肌可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA 与蛋白质分离，并将 RNA 释放到济液中。加入氯仿后离心，样品分成水样层(无色)和有机层(黄色)。RNA 存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

图源：解螺旋

Trizol法提取RNA操作步骤

需要的试剂：

氯仿
异丙醇
75%乙醇（in DEPC-treated water)
RNase free水或者0.5% SDS溶液 [准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]

1、匀浆并裂解样本：

组织样本：每10~100mg组织加入1ml TRNsol，建议使用机械匀浆器来匀浆。另外也可用液氮来破碎组织，用研钵、研杵把组织粉碎后，把粉末转移至一干净的1.5ml小离心管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。。样本的体积应不超过所使用的TRNsol的体积的10%，否则会出现DNA污染。

悬浮培养的细胞：离心沉淀收集细胞。1ml的TRNsol试剂可用于处理(5~10)×106个动物、植物或酵母细胞，或1×108个细菌细胞。在加入TRNsol前应避免洗涤细胞，因为这样可以增加mRNA降解及RNA酶污染的可能性。对植物、真菌和酵母细胞，通常需要进行机械匀浆或酶解。

单层贴壁培养的细胞：通过直接把1ml TRNsol加至一直径为3.5cm的培养皿的方法来裂解细胞，用枪头吹打裂解物几次。TRNsol的用量随培养皿的面积而定（1ml/10ml）。如果加的TRNsol不足，则会导致在分离得的RNA中有DNA污染。如果裂解物用枪头吸起来时很粘稠，往往需多加些TRNsol。

血液样品：250μl的新鲜全血加750μl TRNsol，剧烈颠倒混匀。注：第二步操作中，加入氯仿的量为0.2ml。

2、相分离

每1 ml TRNsol中加0.2 ml 氯仿。盖上离心管盖子，剧烈地振荡15sec，在冰上孵育5 min。室温下，12,000×g下离心10min。此时混合物分成三层：底层为苯酚氯仿相层（红色），中间层，和上层水相层（无色）。水相占总TRIZOL的60%，RNA完全存在于水相中。

3、RNA沉淀

转移不多于80%上层水相至新的离心管中，往水相中加入异丙醇，每使用1ml的TRNsol，加入 500μl的异丙醇(注：如果是含多糖、多酚的植物样品，请加入300μl异丙醇的同时加入300μl 0.8M 柠檬酸钠/1.2M NaCl混合液)。涡旋混匀，室温下放置10min，然后在4度下12,000×g离心10min，离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。糖类丰富的样本：富含多糖的植物样本或富含糖胺聚糖和蛋白质聚糖的动物样本需要使用以下的修饰的沉淀方法来获得纯的RNA。准备1份Buffer A（1.2M NaCl，0.8M柠檬酸钠）。做完第二步后，紧接着依次往水相中加入异丙醇和Buffer A （1ml TRNsol加0.3ml的异丙醇和0.3ml的Buffer A）。旋涡混匀，并在室温下,≤12,000×g离心10min，这一高盐沉淀会减少复杂糖类的共同纯化。