一文详解基因敲除/敲低/敲入的区别

一文详解基因敲除/敲低/敲入的区别

基因编辑技术是现代生物科学研究的重要工具，其中基因敲除、基因敲低和基因敲入是最常见的三种方法。虽然它们的名字听起来相似，但其实验原理、操作方法和应用效果却大不相同。本文将通过图文结合的方式，为您详细解析这三种基因编辑技术的异同。

一、基因敲除

原理

基因敲除是通过含有一定已知序列的小DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

载体

• CRISPR/Cas9载体：通过Cas9核酸酶和SgRNA靶向序列精确定位并靶向基因DNA序列，然后引入双链断裂点，完成基因敲除。
• TALENS载体：包含特异性核酸酶和nuclease binding domain，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。
• ZFNS载体：包含具有特异性的锌指结构域和核酸酶，通过切割靶向基因DNA序列，完成敲除和编辑。

载体构建方法

1. 设计和选择：设计基因敲除的靶点，选择CRISPR/Cas9等工具进行编辑。
2. 载体插入：将编辑过的靶点序列插入到特定的载体中。
3. 转化和验证：转化编辑好的敲除载体至大肠杆菌中，进行筛选鉴定，验证敲除效果。
4. 导入目标细胞：通过病毒载体、电穿孔等方法将敲除载体导入到目标细胞中。

二、基因敲低

原理

基因敲低又称基因敲降，是利用抑制剂来抑制基因的表达过程。主要的抑制方式有RNA干扰技术（RNAi）、CRISPR-Gas9技术和基因转染技术。

载体

• SiRNA载体：短干扰RNA。在3'端有两个碱基的游离，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列，特异性地实现靶向mRNA降解。
• ShRNA载体：短发夹RNA。一种SiRNA前体，包括一个“茎”和一个“环”结构，由RNA序列的短区域（这些区域形成“茎”）之间的碱基配对形成，由不形成碱基对的短序列（形成“环”）隔开。
• CRISPRi载体：包含CRISPRi靶向序列和转录抑制子，通过抑制靶向基因的转录水平实现基因敲低效果。

载体构建方法

1. 设计干扰序列：采用在线设计工具或经验公式来计算。
2. 合成和克隆：合成干扰序列的DNA或RNA小片段，并克隆到转录载体中，生成SiRNA或shRNA表达载体。
3. 转化和筛选：将siRNA或shRNA表达载体转化至大肠杆菌中，进行筛选鉴定。
4. 导入目标细胞：通过病毒等途径将重组质粒导入目标细胞中。

三、基因敲入

原理

利用基因同源重组，将外源的功能基因（基因组原先不存在、或已失活的基因）转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。

载体

• SgRNA-Cas9载体：在KI基因编辑系统中像一把“剪刀”，可以精准切开双链DNA，这把“剪刀”锋利与否和精确度能直接影响KI基因编辑系统的编辑效率。
• Donor DNA：一段高度同源的DNA模板。以Donor DNA为模板进行修复，可以将目的片段定点引入基因组。

载体构建方法

1. 设计sgRNA及修复DNA模版：为了保证sgRNA没有预测的脱靶结合位点，根据人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计SgRNA，并进行软件分析。设计DNA修复模版，其两侧各有600bp的同源臂。
2. 构建sgRNA质粒及修复DNA模板质粒：选定sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因，将其克隆到pCas-Guide中来制备pCas-Guide-AAVS1;再将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体。
3. 将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞：用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。