菌种保藏技术详解：原理、方法与影响因素

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菌种保藏技术详解：原理、方法与影响因素

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菌种保藏是保持微生物菌株活力和遗传性状的重要技术。在使用和传代过程中，微生物容易发生污染、变异甚至死亡，因此需要通过特定的方法来保持菌种的活性和特征。本文将系统介绍菌种保藏的原理、步骤、常见方法及其影响因素。

一、菌种保藏的原理

根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用，因此上述条件也是完成菌种保藏的重要手段。选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用，以提高保藏效果。目前常用的保菌方法有：甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液体石蜡覆盖保藏法、沙土保藏法、冷冻干燥法。

二、菌种保藏步骤

常见的菌种保藏的一般步骤如下：

挑选特征典型的纯菌菌落
确定保藏的合适菌体形态
选择最适宜的保藏方法
定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。

三、常见保藏方法

3.1 甘油保菌法

此方法适用于菌种的中长期保藏，是目前使用较为广泛的长期保藏法之一，操作简单、保藏期长，且菌种不容易发生变异。甘油保菌法适用于各类微生物，保藏时间可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠，很难定量，因此一般将甘油和生理盐水按1:1的比例配成终浓度为50%的甘油溶液。使用时，按50%甘油：菌液=1:1的比例混合，使甘油终浓度在20-30%即可，甘油浓度过高或过低都不利于菌种保藏。将甘油菌种转移至-60~-80℃冰箱长期冻存。需要取用菌种的时候，将冻存管放在37℃水浴中快速解冻，直到菌种完全融化，此时可取出菌种进行实验，切勿常温融化。此外，应该注意不要对菌种进行反复冻融，避免死亡。

图1 用甘油冻存菌种

3.2 斜面保菌法

斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作简单，使用方便，不需要额外的特殊设备，但需定期接种。因此工作量较大，而且传代次数多、易发生变异，且此方法污染杂菌的机会较高。因此，仅适用于短期经常使用的菌种。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后转移至4℃冰箱中保藏。保藏的时间根据微生物的种类而不同，一般大肠杆菌每一个月就需要移种一次，酵母菌则为2个月。需要取用菌种的时候，可用接种环在斜面上挑取少量菌体进行接种。在具体实验操作中，应该注意：

斜面装液量以倾斜后不超过试管长度1/2为宜
培养温度应较最适温度稍低，时间应较最适时间略长
保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物

图2 斜面保藏菌种

3.5 沙土保藏法

沙土保藏法是典型的载体保藏法，即将菌种吸附在载体沙子上然后进行干燥的保藏方法，其使用相当广泛。具体工艺步骤为，将培养好的菌种与无菌沙土混合，使菌体吸附在沙土载体上，干燥后转移至4℃冰箱保存。需要取用菌种的时候，取出少量沙土颗粒即可。大肠杆菌、酵母菌均可用此法保藏2年左右。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备，且保藏时间长。

3.6 冷冻干燥法

冷冻干燥法为先使微生物处在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压条件下利用升华现象除去水分，其中以真空冷冻干燥法最常见。菌种在升华的过程中水分被去除，细胞的生理活动趋于停止，从而使菌种长期维持存活的状态。需要取用菌种的时候，用无菌水或培养基重悬菌体，将菌悬液转移至固体培养基平板上进行培养。此方法适用于菌体的长期保存，但是相关的设备和操作相对其他几种保藏方法都比较复杂。