大肠杆菌中的噬菌体：特性、污染与防治

大肠杆菌中的噬菌体：特性、污染与防治

噬菌体是感染多种细菌、真菌、螺旋菌等微生物的细菌病毒总称，具有病毒的特点，一旦离开宿主细胞，噬菌体既不能存活也不能复制。噬菌体是原核生物病毒，非常微小其直径仅为0. 1 μm，因此不能被除菌滤器除去。同时，它不具有完整细胞结构，其结构主要由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成。此外，其还具有非常专一的寄生性，在自然环境条件下，它们只能入侵细菌和一些原生生物，而不能攻击高等生物和植物。

图1 噬菌体结构示意图

噬菌体的分类和污染后的表现

噬菌体有烈性噬菌体与温和噬菌体之分。烈性噬菌体可以在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，达到一定数量时，由于噬菌体合成酶类的溶解，导致宿主细胞裂解，释放出的噬菌体再感染其他敏感细菌。而温和噬菌体感染宿主菌后并不增殖，而是将其基因整合于细菌染色体上，形成前噬菌体。在前噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。

生产或科研中使用的菌株，若被菌体污染，常有异常表现：接种的斜面或克氏瓶生长的菌苔上出现不长菌的透明区：液体发酵过程镜检菌体染色不均匀，细胞形态不整齐或膨大呈将破裂状，活细菌数目减少;发酵过程糖消耗减慢氨基氮和 pH 变化异常;发酵液稀薄，发酵终产物产率降低等异常状况。

如何预防噬菌体污染

由于噬菌体对于大肠杆菌的危害性，日常实验室中对其进行污染防治工作就显得格外重要，要严格保证实验室的洁净与规范操作，详细的防治可包括以下细则：（1）外来可疑菌种一律不做增殖；（2）多菌种交替使用，采用抗噬菌体的感受态；（3）划分大肠杆菌的操作区域，接种区、发酵区、收菌区、菌种保藏区要严格分开；（4）严禁活菌排放，废菌高压灭菌后方可倾倒；（5）规范操作，避免污染；（6）保证洁净，干燥的工作环境；（7）采用无菌技术：确保在实验中使用无菌技术，包括使用无菌试剂和培养物，以减少噬菌体的引入；（8）维护洁净实验室环境：维持实验室的清洁，定期消毒实验室表面和设备，以减少噬菌体的传播；（9）遵循规范操作程序：遵守实验室安全和操作规程，包括正确处理和处置垃圾，以避免噬菌体污染的风险；（10）储存培养物：定期检查并维护细菌培养物库存，确保培养物的纯度，以减少噬菌体感染的风险。

清除噬菌体的污染

除了严格做好噬菌体的污染防治工作，如果感染已经发生，则及早采取清除措施是至关重要的。具体的消灭噬菌体以及清楚污染源的方法有：（1）噬菌体的消灭：a.表面消毒-对于物品表面采用84或酒精进行消毒；b.高温-大多数病毒耐冷不耐热，高压蒸汽或者干热180°C可彻底灭活；c. 紫外照射-紫外过夜照射；（2）隔离被感染的细菌培养物：如果怀疑培养物受到噬菌体感染，将其与其他细菌隔离，以阻止感染传播；（3）使用抗噬菌体剂：一些抗噬菌体剂可以用于清除感染；（4）冻存备份培养物：定期冻存备份培养物，以便在感染发生时能够重新开始培养而不受噬菌体污染影响；（5）培养敏感细胞株：对于特别敏感的细胞株，可以选择使用已知无噬菌体感染的培养物，以减少感染风险。

双层琼脂平板法测定噬菌体

目前常采用生物测定法进行噬菌体检查，具体为显微镜直接检查、离心分离加热、平板交叉划线、单层平板法、双层平板法。其中，以双层琼脂平板法形成的噬菌斑大小接近、边缘清晰、便于计数，而广泛用于噬菌体的检测。

双层琼脂平板法测定噬菌体

利用双层琼脂平板法测定噬菌体时，先融化下层培养基，以每板约10mL/皿倒平板。后融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL混合后立即倒入上层平板铺平。30℃恒温培养6～12h观察结果。如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形的空斑，即为噬菌斑。

双层琼脂平板法测定噬菌体效价

噬菌体的效价的测定，对于后续开展的噬菌体污染防治和清楚工作意义重大。噬菌体效价指噬菌体的浓度，通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑，以计算每毫升中含有的噬菌斑形成个数（plaque forming unit/ml或pfu/ml)。效价的测定一般也采用双层琼脂平板法。理论上，一个噬菌体粒子应形成一个噬菌斑，但可能有少数活噬菌体未能侵染，噬菌斑计数结果往往比实际活噬菌体数偏低。

5.2.1 倒平板

将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。

5.2.2 稀释噬菌体

按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6的稀释度。

5.2.3 噬菌体与菌液混合

将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中。每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液。振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。

5.2.4 接种上层平板

将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。

5.2.5 观察并计数

观察平板中的噬菌斑，并将结果记录后进行计算。一般测量3个梯度的噬菌体效价，选取每皿有30～300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价并取其平均值进行计算，计算公式为 N=Y/V•X（Ｎ：效价值，Ｙ：平均噬菌斑数／皿，Ｖ：取样量，Ｘ：稀释度）。