揭秘病毒生命周期的分子细节：Direct RNA测序技术的全面应用

揭秘病毒生命周期的分子细节：Direct RNA测序技术的全面应用

Direct RNA测序（DRS）技术基于Nanopore测序平台，能够直接读取全长转录本，无需反转录和扩增，具有检测单碱基RNA修饰、分析可变剪接和鉴定新转录本等独特优势。近年来，DRS技术在病毒研究领域展现出巨大潜力，特别是在揭示病毒生命周期、变异监控和宿主-病毒互作等方面。本文将通过多个具体案例，展示DRS技术在病毒研究中的应用及其重要发现。

Direct RNA测序技术的优势

Direct RNA测序（DRS）基于Nanopore测序平台，具有以下特点：

• 无需反转录和扩增：直接读取全长转录本
• 无测序偏好性：能够准确检测单个RNA分子上的m6A、m5C和假尿苷等RNA修饰位点
• 全面分析能力：能准确分析可变剪切、APA、融合基因和鉴定新转录本
• Poly(A)长度估算：对单个RNA分子的Poly(A)长度进行相对准确的估算

DRS技术在病毒研究中的应用

病毒基因组结构与变异分析

DRS能够捕获RNA病毒的完整转录本，包括其可能存在的剪接变异体和结构变异，有助于揭示病毒的遗传多样性及其进化动态。这对于监测病毒如SARS-CoV-2等的突变非常重要，这些突变可能影响病毒的传播能力、致病性和对抗病毒药物及疫苗的敏感性。

病毒转录本异构体分析

许多病毒具有复杂的转录调控机制，产生不同长度或剪接形式的mRNA。DRS可以直接检测到这些转录本异构体，帮助理解它们在病毒生命周期和致病机理中的作用。

宿主-病毒相互作用研究

通过同时捕获宿主细胞和病毒的RNA，DRS技术能够揭示病毒感染期间宿主转录组的变化，包括宿主防御机制的激活、细胞因子反应以及病毒可能利用或抑制的宿主途径，这对于发现新的治疗靶点至关重要。

病毒RNA修饰分析

某些RNA病毒的RNA分子上存在甲基化、假尿嘧啶化等修饰，这些修饰可能影响病毒RNA的稳定性、翻译效率或逃避宿主免疫识别。DRS技术能够在一定程度上保留并检测这些化学修饰信息，有助于深入理解病毒的生存策略。

感染动力学研究

通过追踪特定病毒RNA序列在不同时间点的丰度变化，DRS可以帮助描绘病毒在宿主体内的复制和扩散动态，为了解病毒感染进程提供时间分辨率更高的数据。

具体案例分析

案例一：SARS-CoV-2转录结构的复杂性

研究题目：《The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome》
发表期刊：Cell
影响因子：66.85
发表时间：2020.5

该研究使用DRS和DNB-seq两种测序技术，构建了SARS-CoV-2转录组和表观转录组的高分辨率图谱。研究发现，除了已知的基因组RNA和9种亚基因组RNA外，SARS-CoV-2还能产生编码未知开放阅读框(ORFs)的转录本，这些ORFs可能涉及融合、缺失或移码现象。DRS鉴定到病毒转录本上至少有41个RNA修饰位点，其中最频繁出现的motif为AAGAA。被修饰的RNA具有更短的Poly(A)尾巴，提示这种修饰与3'端尾巴之间存在关联。

图1 Direct RNA测序揭示SARS-CoV-2转录结构的复杂性

案例二：HIV-1 RNA的表观转录组分析

英文标题：Single-molecule epitranscriptomic analysis of full-length HIV-1 RNAs reveals functional roles of site-specific m6As
发表期刊：Nature Microbiology
IF：28.3
发表时间：2024.4

该研究使用DRS方法，在全长、单个RNA水平和单核苷酸分辨率上分析了HIV-1 RNA上的化学修饰。结果显示，HIV-1的修饰意外地简单，重点揭示了3′末端附近的三个关键的N6-甲基腺苷（m6A）修饰。这些m6A修饰在剪接的病毒mRNA中比在基因组RNA中更密集，在维持HIV-1 RNA正常剪接和翻译水平方面发挥着关键作用。同时发现HIV-1产生具有不同m6A组合的多种RNA亚种，通过保持多种m6A模式增强其稳定性和适应性，提出了一种基于RNA水平的新型病毒进化策略。

图2 全长HIV-1 RNA的DRS表明了m6A位点的特异性功能

案例三：胞质RNA病毒的m6A修饰验证

文章标题：N6-methyladenosine modification is not a general trait of viral RNA genomes
发表杂志：Nature Communications
IF：16.6
发布时间：2024.3

该研究采用SELECT技术和DRS技术，对基孔肯雅病毒（CHIKV）和登革热病毒（DENV）的m6A修饰进行了全面的分析。研究结果显示，在CHIKV和DENV RNA中并未发现支持m6A修饰的证据，并且敲低宿主m6A修饰酶不影响病毒感染进程，同时证实病毒感染不会改变核内m6A修饰。该研究反驳了m6A修饰普遍存在于胞质RNA病毒的观点，并强调利用多种技术验证RNA修饰的必要性。

图3 CHIKV RNA的DRS分析没有检测到抗体依赖性m6A peak内的修饰

案例四：腺病毒RNA的m6A修饰

英文标题：Direct RNA sequencing reveals m6A modifications on adenovirus RNA are necessary for efficient splicing
发表期刊：Nature Communications
IF：14.919
发表时间：2020.11

该研究采用MeRIP-seq与DRS相结合的方法，以检测腺病毒转录组的m6A修饰。尽管早期和晚期病毒转录本均含有m6A，但m6A甲基转移酶METTL3的缺失，特异性影响了病毒晚期转录本的表达，降低了转录本的剪接效率。该研究使用了DRS技术，这是一种能够在单个转录本水平实现单核苷酸分辨率m6A修饰的新技术。并强调了m6A在调控病毒病原体剪接中的作用。

图4 使用Direct RNA测序进行m6A检测的统计学框架

案例五：乙型肝炎病毒的m5C修饰

英文标题：Epigenetic addition of m5C to HBV transcripts promotes viral replication and evasion of innate antiviral responses
发表期刊：Cell Death & Disease
发表时间：2024.1

该研究发现HBV mRNA中特定的m5C位点（如nt 1291）对病毒mRNA输出、HBx蛋白翻译及干扰素-β(IFN-β)抑制具有重要作用。NSUN2酶是催化m5C修饰的关键酶，但其活性受HBx蛋白转录水平的调控，这种调控是通过HBx蛋白影响EGR1与NSUN2基因启动子区域的相互作用实现的。此外，NSUN2的表达与宿主细胞内I型干扰素mRNA的m5C含量紧密相关，进而调控干扰素表达。

该研究表明，通过调控NSUN2表达可改变HBV mRNA的m5C修饰，并降低宿主IFN mRNA的m5C水平，这在HBV生命周期中起着关键作用。这些新发现揭示了HBV如何通过m5C调控机制来抑制IFN反应，并为开发基于IFN-α的新型治疗策略提供了指导。

图5 HBV如何调节宿主RNA甲基转移酶NSUN2以促进其复制的模型图

案例六：SARS-CoV-2 RNA的假尿苷修饰

英文标题：Unveiling the role of PUS7-mediated pseudouridylation in host protein interactions specific for the SARS-CoV-2 RNA genome
发表期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids
发表时间：2023.10

该研究采用了catRAPID算法，并结合基于质谱技术的RNA-蛋白相互作用检测方法，来预测并验证那些专门结合SARS-CoV-2 RNA高度结构化的5′端和3′端区域的宿主蛋白。在已识别的相互作用中，作者优先考虑了假尿嘧啶合酶PUS7，它能同时结合病毒RNA的两端。通过Nanopore DRS技术，发现病毒RNA经历了广泛的转录后修饰。在SARS-CoV-2 RNA的两个末端区域，包括病毒转录调控序列的引导序列中，鉴定了PUS7的修饰共识区域。

图6 PUS7介导的假尿苷修饰影响SARS-CoV-2 RNA基因组与宿主蛋白的特异性相互作用

参考文献

1. Kim D, Lee JY, Yang JS, Kim JW, Kim VN, Chang H. The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome. Cell. 2020.
2. Ding, S., Liu, H., Liu, L. et al. Epigenetic addition of m5C to HBV transcripts promotes viral replication and evasion of innate antiviral responses. Cell Death Dis 15, 39 (2024).
3. Baquero-Pérez, B., Yonchev, I.D., Delgado-Tejedor, A. et al. N6-methyladenosine modification is not a general trait of viral RNA genomes. Nat Commun 15, 1964 (2024).
4. Baek, A., Lee, GE., Golconda, S. et al. Single-molecule epitranscriptomic analysis of full-length HIV-1 RNAs reveals functional roles of site-specific m6As. Nat Microbiol (2024).
5. Price, A.M., Hayer, K.E., McIntyre, A.B.R. et al. Direct RNA sequencing reveals m6A modifications on adenovirus RNA are necessary for efficient splicing. Nat Commun 11, 6016 (2020).
6. Giambruno R, Zacco E, Ugolini C, et al. Unveiling the role of PUS7-mediated pseudouridylation in host protein interactions specific for the SARS-CoV-2 RNA genome. Mol Ther Nucleic Acids. 2023.