中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）：形成、应用、诱导、检测！

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）：形成、应用、诱导、检测！

中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps，简称NETs）是由解压的细胞外染色质丝组成的丝状网状结构，主要由中性粒细胞的DNA、组蛋白和细胞毒性颗粒衍生蛋白等构成。中性粒细胞（PMN）的功能主要是通过脱颗粒、吞噬作用和形成NETs来发挥作用。

NETs的形成机制

NETs是PMN细胞响应多种病原体而形成的丝网状胞外结构。其形成过程涉及活性氧（ROS）和组蛋白瓜氨酸化。具体来说，NETs将病原体包裹在DNA、组蛋白、蛋白酶和其他细胞毒性和高度炎症化合物的网络中，以杀死病原体。在NET形成时，会依赖ROS、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白（NE）来降解组蛋白，解聚染色体。NE同时会降解肌动蛋白骨架，阻碍其移动和吞噬的能力。核膜和颗粒膜溶解。最后，NE激活Caspase11，Casepase11与膜上的Gasdermin-D结合，使质膜完整性丧失，NETs被释放到胞外空间。Gasdermin D是一种成孔的细胞质蛋白，在质膜通透性的后期阶段牵涉其中。质膜破裂后，含有颗粒蛋白的瓜氨酸核DNA支架以云的形式释放在细胞外空间，导致中性粒细胞死亡。

因此，NETs的基本特征是中性粒细胞发生剧烈形态变化的同时释放疏松的染色质、瓜氨酸化组蛋白和抗菌肽到细胞外空间并形成网络，此过程称为NETosis。这种中性粒死亡方式又不同于凋亡和坏死，因为NETs形成早于凋亡，不依赖于caspase3，也不伴随DNA片段形成。中性粒活化的过程伴随着NETs形成。阻断IL8-CXCR2轴、阻断CXCR1和CXCR2可以抑制各自诱导的NETs形成过程。

NETs的应用

肿瘤

在肿瘤微环境中，肿瘤细胞释放细胞因子和趋化因子，如IL-8、G-CSF、CXCL5和CXCL6，从血液中招募PMN到肿瘤部位以释放NETs。NETs在肿瘤细胞周围形成网络，通过物理屏障作用保护肿瘤细胞免受细胞CTL和NK细胞的杀伤。NET衍生的NE激活肿瘤细胞上的TLR4信号传导，促进线粒体产生ATP，从而促进肿瘤的发展。随后，NET促进癌细胞迁移，分别通过NET-DNA诱导肿瘤的趋化作用和诱导EMT促使上皮衍生的癌细胞具有侵袭性的特点这两种机制。在血管生成中，NET可以影响内皮细胞间接触并增加其通透性，也有人认为NET相关蛋白酶可以帮助肿瘤建立其所需的血液供应。并且NETs可以通过多种手段抑制免疫生态位的形成。值得注意的是，NETs也有抗肿瘤作用。

各项研究表明,癌症患者中高水平的 NETs 与更差的预后、转移、早期复发密切相关，这有望作为癌症诊断和预后标志物。应用 DNA酶 (DNase) 或肽精氨酸脱亚胺酶4 (Peptidylarginine Deiminase 4, PAD4) 抑制剂、NE抑制剂等药物，能够阻止NETs的形成，进而消除NETs促进肿瘤转移的效应。

心血管

NETs可损伤内皮细胞，诱导血小板活化形成血管内血栓。癌症也是一种血管疾病。由于肿瘤周围细胞丢失和血管完整性差，组织因子（TF）和细胞外基质（ECM）在血管内暴露诱导血小板活化和NET的形成。NETs跟血小板可以诱导血管重塑，一旦被激活，将促进其他器官的血管功能障碍。

各种生活方式危险因素（如吸烟、不良饮食和压力）或代谢危险因素（如肥胖、糖尿病、高血糖、高胆固醇血症或代谢综合征），可能与癌症相互影响，从而放大癌症对血管健康的影响。

血浆中的NETs相关生物标志物水平在冠心病、缺血性脑卒中和静脉血栓栓塞症时发生显著改变，并与病情严重程度、临床结局显著相关。

中性粒细胞胞外诱捕网的诱导

分离后的中性粒细胞用无血清的培养基培养。用50nM的PMA诱导中性粒细胞4h得到NETs，去除培养基，用培养基清洗孔（在此浓度下，PMA不促进细胞凋亡或坏死，但引起NETs形成的特征性特征）。去除上清后，用移液器移取2ml冷PBS洗下粘附在底部的NETs，然后在4 °C下以1，000g离心10分钟，在20 xg离心5分钟后，获得上清。收集含有NETs （DNA -蛋白质复合物）的无细胞上清液。NETs的DNA浓度采用DNA定量试剂盒测定。分离的NETs立即使用或液氮速冻。

中性粒细胞胞外诱捕网的检测

针对NETs的研究方法较多，大多是通过不同手段检测NETs的标志物来评估NETs的形成。

ELISA法检测MPO-DNA等NETs重要组分的水平

比健康人群、脓毒症患者以及脓毒症肺损伤患者NETs水平

通过电镜进行定性检测NETS

扫描电镜观察了非AIC和AIC之间术前和术后腹水中分离的中性粒细胞以及NETs水平差异

通过蛋白质印迹法（Western blot）检测MPO、NE、cit-H3 的表达量

免疫荧光观察NETs

免疫荧光检测citH3 比较癌和癌旁NETs水平差异

正常组、脓毒症组、脓毒症ARDS组NETs水平差异

免疫荧光标记MPO、citH3和Hoechst33342染色，表明小鼠结肠中强烈的中性粒细胞浸润

通过DNA、组蛋白和中性粒细胞颗粒标志物的共定位来鉴定NETs

参考文献

1. Fang Q, Stehr AM, Naschberger E, Knopf J, Herrmann M and Stürzl M (2022) No NETs no TIME: Crosstalk between neutrophil extracellular traps and the tumor immune microenvironment. Front. Immunol. 13:1075260. doi: 10.3389/fimmu.2022.1075260

2. Adrover JM, McDowell SAC, He XY, Quail DF, Egeblad M. NETworking with cancer: The bidirectional interplay between cancer and neutrophil extracellular traps. Cancer Cell. 2023 Mar 13;41(3):505-526. doi: 10.1016/j.ccell.2023.02.001. Epub 2023 Feb 23.

3. Guillotin F, Fortier M, Portes M, et al. Vital NETosis vs. suicidal NETosis during normal pregnancy and preeclampsia[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2022, 10.

4. Chen Q, Zhang L, Li X, et al. Neutrophil Extracellular Traps in Tumor Metastasis: Pathological Functions and Clinical Applications[J]. Cancers, 2021, 13, 2832.

5. Kaltenmeier C, Yazdani HO, Morder K, Geller DA, Simmons RL and Tohme S (2021) Neutrophil Extracellular Traps Promote T Cell Exhaustion in the Tumor Microenvironment. Front. Immunol. 12:785222. doi: 10.3389/fimmu.2021.78522

6. Hao, Zhang,Jinlong, Liu,Yilu, Zhou et al. Neutrophil extracellular traps mediate m(6)A modification and regulates sepsis-associated acute lung injury by activating ferroptosis in alveolar epithelial cells.[J] .Int J Biol Sci, 2022, 18: 0.

7. Xiang, Xia,Zizhen, Zhang,Chunchao, Zhu et al. Neutrophil extracellular traps promote metastasis in gastric cancer patients with postoperative abdominal infectious complications.[J] .Nat Commun, 2022, 13: 0.

8. Xi, Zhan,Rui, Wu,Xue-Hua, Kong et al. Elevated neutrophil extracellular traps by HBV-mediated S100A9-TLR4/RAGE-ROS cascade facilitate the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma.[J] .Cancer Commun (Lond), 2022, 43: 0.

9. Elliot Yi-Hsin, Lin,Hsuan-Ju, Lai,Yuan-Kai, Cheng et al. Neutrophil Extracellular Traps Impair Intestinal Barrier Function during Experimental Colitis.[J] .Biomedicines, 2020, 8: 0.

10. Kai, Kessenbrock,Markus, Krumbholz,Ulf, Schönermarck et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.[J] .Nat Med, 2009, 15: 0.