用Image J测量荧光强度的3种方法
用Image J测量荧光强度的3种方法
荧光实验完成后得到的图片只能通过肉眼观察荧光强弱，如何将荧光强度数值化呢？可以通过 ImageJ 进行平均荧光强度半定量分析，方法有多种，这里分享3种简单的方法。
对于一张单通道（单色）的荧光图片，每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小，特定区域的荧光强度公式：平均荧光强度(Mean) = 该区域荧光强度总和(IntDen) / 该区域面积(Area)
测量参数设置步骤
Analyze→Set Measurements
Area：所框选区域面积
Mean：框选区域平均灰度值
Integrated Density：IntDen，框选区域荧光总强度
选择好测量参数之后点击OK。
方法一：RGB measure
原理是直接测量RGB三原色，这种方法建议框选的区域尽量小，可以把图片放大再框选，这样测量结果数值比较大，误差小。
打开需要分析的荧光图片，File-Open
选择菜单栏的矩形选框，框选荧光团，然后点击菜单栏Plugins--Analyze--Measure RGB。
如果多个位置或者多个图片需要分析，重复以上步骤即可。
Edit→Copy，将数据拷贝到Excel表中进行后续的数据整理。
方法二：ROI Manger
打开ROI Manger面板后，勾选Show All及Labels
打开需要分析的荧光图片，点击菜单栏Analyze--Tools--ROI Manager，在打开的ROI Manager面板内，点击Add，将图片添加至分析面板内。按照上述步骤框选其它区域或添加其它需要分析的图片。
点中面板内的图片名称后选择Rename，可以对该对象重命名，之后点击OK确定。
Edit→Copy，将数据拷贝到Excel表中。
细心的友友可以发现，同样的2张荧光图以及同样的区域，ROI Manger分析的荧光强度和RGB measure分析的结果不一样，是不是分析的结果有问题？
2种分析方法的结果都是对的，但是ROI法分析的荧光强度是相对值。
方法三：转化灰度图，调阈值，选中荧光
这种方法和定量分析免疫组化图的步骤一致。
打开分析图片，菜单栏Image--Type--8bit，图片由彩图变为灰度图。
Image→Adjust→Threshold，调阈值，去除背景，选中荧光，之后点击set，ok
菜单栏点击Analyze-Set measurements，调整参数
菜单栏选择Analyze-Measure，得出结果
注意：RNA FISH或免疫荧光是半定量分析，平均荧光强度只能半定量地表征RNA或特异性蛋白的表达。主要是因为免疫荧光实验中的人为因素太多，例如拍照时的曝光、焦距等等，而且非特异性结合的因素也不能完全消除。所以我们在拍照的时候，以及处理数据的时候，一定要有一个固定的标准和流程，从而减小误差。