一种用于液体活检生物标志物（ctDNA）检测的微流控芯片

一种用于液体活检生物标志物（ctDNA）检测的微流控芯片

液体活检技术是近年来生物医学领域的研究热点，其中ctDNA（循环肿瘤DNA）的检测对于癌症的早期诊断和治疗监测具有重要意义。本文介绍了一种基于离心芯片的微流控技术，用于从全血中高效提取cfDNA（循环游离DNA），整个过程仅需15分钟，血浆中cfDNA的回收率可达65%，全血中cfDNA的回收率为30%。

芯片结构与原理

如图1所示，该微流控芯片直径为100mm，主要由两部分组成：血浆分离和转移部分，以及核酸分离部分。血浆分离采用离心法，漏斗状腔室可容纳4mL全血。虹吸通道中设计有空气阀，以防止采样过程中血液在毛细管作用下进入样品腔。

cfDNA的提取和纯化过程如图2所示。腔室间通过拱状毛细管微通道连接，微通道高度为200μm，宽度从400μm到3mm不等。该结构的关键在于保持各相的不混溶性，并确保磁珠转移过程中形成稳定的界面。

为了实现不混溶相中磁珠的稳定转移，设计了拱状通道（图2放大图）。在微尺度上，表面张力起主导作用，形成虚拟的水-空气“墙”和空气-油“墙”，以防止水和油在芯片静止期间混合。同时，对空气微腔表面进行聚四氟乙烯处理，以增强界面稳定性。

芯片制作与操作流程

芯片实物图如图3所示。制作流程包括CNC加工模具、PDMS涂覆和玻璃片粘接等步骤（图5）。

样品加载过程如下：首先将4mL全血（掺有HBV片段短DNA）加入血浆分离腔；然后依次加入15μL二氧化硅包被的磁珠、1.25mL裂解/结合缓冲液和50μL洗脱液；最后注入400μL硅油作为不混溶相。

血浆分离过程分为几个关键步骤：芯片先缓慢加速至120rpm以保持界面稳定，然后加速至3600rpm持续4分钟进行血浆分离。在细胞沉降后，通过减速激活虹吸阀，将1.6mL血浆转移至收集腔。

cfDNA提取阶段，通过加减速混合磁珠、血浆和裂解/结合缓冲液，以高效结合cfDNA。随后，利用外部磁铁将磁珠穿过不混溶相进入洗脱缓冲液，实现cfDNA的纯化。最后通过混合将核酸从磁珠表面洗脱，收集上清液用于下游检测。

关键技术要点

在血浆分离过程中，离心速度和时间的控制至关重要。过快的离心速度可能导致溶血，即红细胞破裂释放内部物质。合理的离心参数需要平衡分离效率和样本完整性。

图7展示了血浆分离后的转移过程，通过50rpm/s的减速度降至350rpm激活虹吸阀，然后以20rpm/s的加速度转移血浆。图8显示了cfDNA提取的具体操作步骤，包括混合和磁珠转移。

溶血现象的判断

溶血是指红血细胞在一定条件下破裂并释放血红蛋白等细胞成分的过程。判断是否发生溶血通常通过以下方法：

• 颜色变化：溶血会导致液体颜色从红色变为粉红色或透明。
• 吸光度测量：使用分光光度计测量液体的吸光度，溶血会导致血红蛋白浓度增加。
• 红细胞计数和形态观察：通过显微镜观察红细胞数量和形态变化。
• 血红蛋白测量：使用比色法或电化学法测定液体中的血红蛋白浓度。
• 血浆游离血红蛋白测定：检测游离血红蛋白的浓度。
• 细胞膜标记物测定：测量红细胞膜上的特定标记物，如LDH和钾离子。

这种微流控芯片技术为液体活检提供了快速、高效的解决方案，具有重要的临床应用前景。