在mRNA序列中添加广谱信号肽，让体内细胞变持续的药物工厂。
在mRNA序列中添加广谱信号肽，让体内细胞变持续的药物工厂。
德州大学西南医学中心Daniel Siegwart课题组在mRNA药物递送领域取得重要突破，成功筛选出一种普适性的信号肽序列（FVII-SP），可有效促进mRNA编码的治疗性蛋白分泌到细胞外，实现全身循环治疗。这一发现为炎症和自身免疫性疾病的治疗提供了新的思路和方法。
设想一下，如果编码治疗性蛋白的mRNA只能在胞内表达，无法分泌至细胞外，那么其治疗效果将会限制在递送靶标部位的局部组织。然而，有许多炎症和自身免疫性疾病需要治疗性蛋白、酶和抗体的全身循环才能发挥治疗作用。那怎样才能让细胞中mRNA翻译出来的蛋白分泌到外面来呢？很简单，只需要在mRNA序列前端添加信号肽（Signal peptide,SP）即可，但你要找到一条对各种蛋白或者不同类型细胞均适用的SP序列就不那么容易了。偏偏就有人做到了，德州大学西南医学中心Daniel Siegwart课题组经过筛选到了一条普适性的SP序列—FVII-SP。
说起SP，总是离不开蛋白质分选机制和囊泡运输。SP一般位于分泌型蛋白N末端，是一段短氨基酸序列（通常约为15至30个氨基酸）。SP一旦从核糖体中合成出来，就马上会被信号识别颗粒(SRP)识别，核糖体翻译过程暂停，直到SRP与ER（内质网）膜上的SRP受体结合，翻译再次启动。ER上邻近的Sec61易位子复合体会形成管道，SP和新翻译的多肽通过该管道进入内质网腔。翻译完成后，核糖体、SRP和SRP受体通过GTP水解释放，随后，信号肽酶从早期蛋白质中将SP切除，从而允许合成的蛋白质在内质网腔中进行折叠和翻译后修饰，接着，借助COPII介导的囊泡进入高尔基体完成更深度的修饰和最终向胞外分泌的过程。
如何找到一个引导蛋白分泌效率最好的SP序列呢？我们可以从已知的内源性分泌蛋白或者人工构建的分泌型蛋白的SP序列中进行筛选。将候选SP序列添加到报告基因编码序列的前面，以质粒作为表达载体，转染细胞。根据培养基与细胞内检测到的荧光信号，来判断报告基因蛋白的分泌情况，从而筛选出最佳的分泌型SP。
Siegwart选择的候选SP序列分别来自：hAlb（白蛋白），hApoB（载脂蛋白B），hFVII以及gLuc。以mcherry作为报告基因（启动子为SP6），以pCS2-MT质粒作为表达载体，通过Lipofectamine2000转染HeLa细胞。在荧光显微镜下，观察到ApoB/gLuc/FVII-SP-mCherry组培养基中的荧光信号随着时间增加（24h-72h）而不断增强，而在72h的细胞裂解液中未检测到信号。相反，无SP/hAlb-SP-mCherry组的荧光信号只出现在细胞裂解液中，而培养基中未检测到信号。上述候选SP在肝癌细胞Huh7中也得到类似的分泌趋势，这对于肝脏靶向性的递送来说是好事情。总之，FVII-SP-mCherry在Hela细胞和Huh7细胞中的分泌水平最高的。
我们还需要确认以质粒作为表达载体筛选出来的SP是否在mRNA上也能发挥出类似分泌效果？以FVII-mCherry-pCS2-MT质粒最为模板，IVT制备FVII-mCherry mRNA，采用肝脏靶向性LNP转染多个细胞系，在较高的转染剂量和较长的表达时间下，培养基中观察到的荧光蛋白信号更强。Siegwart将FVII-mCherry mRNA称为工程化信号肽设计核酸（SEND），因为你可将SP视作一个可插入mRNA序列的模块。
Siegwart用FVII SP替换hEPO蛋白（人红细胞生成素蛋白）中的内源性N末端S，构建SEND FVII-hEPO mRNA，同时，还构建了对照组NSP（无信号肽）-hEPO mRNA。那么，这种工程化的SEND-mRNA在不同的递送系统（LNP, iPLNPs,Polymer NP）和给药途径(静脉注射 IV，肌内注射 IM，皮内注射 SQ)兼容性如何呢？采用不同的递送载体和给药途径注射NSP-hEPO mRNA后，在小鼠血清中检测不到hEPO，相反，注射FVII-hEPO mRNA后，不管采用何种递送系统或者注射途径均可在小鼠血清中检测到明显的、持续性的hEPO分泌。
Siegwart的终极目标肯定希望将SEND-mRNA用于治疗性蛋白的体内表达，来验证其对需要机体全身循环治疗性蛋白的免疫性疾病或者其他疾病的治疗效果。
依那西普（Enbrel）是一种抑制TNF-α的二聚体融合蛋白，可用于治疗皮炎。在培养基中加入TNF-α（鼠源或者人源）会引起L929细胞死亡，令人感到欣喜的是，不仅FVII SP-Enbrel mRNA LNP预处理L929细胞会以剂量依赖的方式降低TNF-α引起的细胞死亡，而且，FVII SP-Enbrel mRNA LNP预处理L929细胞的培养基也会以剂量依赖的方式降低TNF-α引起的细胞死亡，这充分说明FVII SP在L929细胞也可发挥作用，引导细胞内合成的Enbrel分泌到培养基中，从而抑制TNF-α引发的细胞死亡。
咪喹莫特（imiquimod）是TLR 7/8的激动剂，诱导机体产生I型干扰素、TNF-α等炎症因子，采用咪喹莫特可诱导银屑病小鼠模型，使得鼠皮肤出现类似银屑病的病变,如红斑、鳞屑、表皮增厚等，而注射依那西普蛋白可缓解小鼠皮肤炎症。与对照组相比（mCherry mRNA LNP），小鼠静脉注射FVII SP-Enbrel mRNA LNP后可明显缓解小鼠皮肤炎症。注射FVII SP-Enbrel mRNA LNP比直接注射依那西普蛋白的优势在于可达到更高的血清依那西普蛋白浓度，并且可维系更长的时间。
除了像银屑病这样的自身免疫性疾病，SEND-mRNA是否也可用于肿瘤免疫治疗，抑制肿瘤生长呢？在注射B16F10-Luc细胞的黑色素瘤小鼠模型或者MC38-Luc细胞的腺癌小鼠模型中，静脉注射FVII-Anti PDL1 mRNA LNP（0.5 mg/kg），与对照组（mCherry mRNA LNP）相比，抑制肿瘤生长和提升存活率的效果非常明显。
小结
这项工作最为主要的贡献在于找到了一条相对普适性的SP序列—FVII-SP，介导mRNA编码的蛋白分泌，在各种不同的蛋白、细胞类型、注射途径及递送系统均得到可靠验证，更加重要的是，采用FVII-SP构建的编码治疗性蛋白的mRNA，在银屑病小鼠模型、腺癌及黑色素瘤小鼠模型均取得良好的治疗效果。未来，一方面还需要进一步挖掘或者改造广谱性的SP序列，另一方面，还需要对SP序列介导蛋白正常分泌所需要的条件做深入的机制探讨。
参考文献：
In situ production and secretion of proteins endow therapeutic benefit against psoriasiform dermatitis and melanoma.